Funkcije restrikcijskih enzima, mehanizam djelovanja, vrste i primjeri



restrikcijski enzimi to su endonukleaze koje koriste određene arheje i bakterije kako bi spriječile ili "ograničile" širenje virusa unutar njih. Posebno su uobičajene u bakterijama i dio su njihovog obrambenog sustava protiv strane DNA poznate kao sustav ograničavanja / modifikacije.

Ovi enzimi kataliziraju rezanje dvolančane DNA na specifičnim mjestima, reproducibilno i bez upotrebe dodatne energije. Većina zahtijeva prisutnost kofaktora kao što su magnezij ili drugi dvovalentni kationi, iako neki također zahtijevaju ATP ili S-adenozil metionin.

Restrikcijske endonukleaze otkrili su 1978. godine Daniel Nathans, Arber Werner i Hamilton Smith, koji su za njihovo otkriće dobili Nobelovu nagradu za medicinu. Njegov naziv obično potječe od organizma gdje se prvi put promatraju.

Takvi su enzimi široko korišteni u razvoju metoda za kloniranje DNA i drugih strategija molekularne biologije i genetskog inženjeringa. Njegova obilježja prepoznavanja specifičnih sekvenci i sposobnost rezanja sekvenci u blizini mjesta prepoznavanja čine ih moćnim alatima u genetskom eksperimentiranju.

Fragmenti koje generiraju restrikcijski enzimi koji djeluju na određenu molekulu DNA mogu se upotrijebiti za stvaranje "karte" originalne molekule korištenjem informacija o mjestima gdje je enzim rezao DNA.

Neki restrikcijski enzimi mogu imati isto mjesto prepoznavanja u DNA, ali ne moraju ga nužno rezati na isti način. Dakle, postoje enzimi koji prave rezove koji ostavljaju tupim krajevima i enzime koji smanjuju kohezivne ciljeve, koji imaju različite primjene u molekularnoj biologiji.

Trenutno postoje stotine različitih komercijalno dostupnih restrikcijskih enzima, koje nude različite komercijalne kuće; ti enzimi djeluju kao "običajne" molekularne makaze za različite svrhe.

indeks

  • 1 Funkcije
  • 2 Mehanizam djelovanja
  • 3 Vrste
    • 3.1 Restrikcijski enzimi tipa I
    • 3.2 Restrikcijski enzimi tipa II
    • 3.3 Restrikcijski enzimi tipa III
    • 3.4. Restrikcijski enzimi tipa IV
    • 3.5 Tip V restrikcijski enzimi
  • 4 Primjeri
  • 5 Reference

funkcije

Restrikcijski enzimi služe suprotnoj funkciji polimeraza, budući da hidroliziraju ili prekidaju estersku vezu unutar fosfodiesterske veze između susjednih nukleotida u nukleotidnom lancu..

U molekularnoj biologiji i genetičkom inženjeringu oni su široko korišteni alati za konstrukciju vektora ekspresije i kloniranja, kao i za identifikaciju specifičnih sekvenci. Oni su također korisni za izgradnju rekombinantnih genoma i imaju veliki biotehnološki potencijal.

Nedavni napredak u genskoj terapiji trenutno koristi restrikcijske enzime za uvođenje određenih gena u vektore koji su sredstva za prijenos takvih gena u žive stanice i koji vjerojatno imaju sposobnost da budu umetnuti u stanični genom za izvođenje trajne promjene.

Mehanizam djelovanja

Restrikcijski enzimi mogu katalizirati rezanje dvolančane DNA, iako su neki u stanju prepoznati jednolančane sljedove DNA, pa čak i RNA. Rez se događa nakon prepoznavanja sekvenci.

Mehanizam djelovanja sastoji se u hidrolizi fosfodiesterske veze između fosfatne skupine i deoksiriboze u kralježnici svake trake DNA. Mnogi od enzima mogu rezati na istom mjestu gdje ih prepoznaju, dok su drugi rezali između 5 i 9 parova baza prije ili poslije njega..

Uobičajeno su ti enzimi rezani na 5 'kraju fosfatne skupine, što dovodi do fragmenta DNA s 5' fosforilnim krajem i terminalnim 3 'hidroksilnim krajem.

Budući da proteini ne dolaze u izravan kontakt s mjestom prepoznavanja u DNK, oni se moraju translokirati sukcesivno dok ne dođu na specifično mjesto, možda pomoću "kliznih" mehanizama na lancu DNA..

Tijekom enzimatskog rezanja, fosfodiesterska veza svakog od lanaca DNA je smještena unutar jednog od aktivnih mjesta restrikcijskih enzima. Kada enzim napusti mjesto prepoznavanja i rezanja, to čini kroz nespecifične prolazne asocijacije.

vrsta

Trenutno je poznato pet tipova restrikcijskih enzima. U nastavku slijedi kratak opis svakog od njih:

Tip I restrikcijskih enzima

Ovi enzimi su veliki pentamerni proteini s tri podjedinice, restrikcija, metilacija i drugi za prepoznavanje sekvenci u DNA. Ove endonukleaze su multifunkcionalni proteini sposobni za kataliziranje reakcija restrikcije i modifikacije, imaju aktivnost ATPaze i također DNA topoizomerazu..

Enzimi ovog tipa bili su prve endonukleaze koje su otkrivene, pročišćene su prvi put u 1960-ima i od tada su istraživane s velikom dubinom..

Enzimi tipa I nisu široko korišteni kao biotehnološki alat, budući da mjesto rezanja može biti na promjenjivoj udaljenosti do 1000 parova baza od mjesta prepoznavanja, što ih čini nepouzdanim u smislu eksperimentalne reproduktivnosti..

Tip II restrikcijskih enzima

To su enzimi sastavljeni od homodimera ili tetramera koji režu DNA na određenim mjestima između 4 i 8 bp duljine. Ta mjesta rezanja su tipično palindromna, tj. Prepoznaju sekvence koje se čitaju na isti način u oba smjera.

Mnogi restrikcijski enzimi tipa II u bakterijama izrezuju DNA kada prepoznaju svoj strani karakter, budući da ne posjeduju tipične modifikacije koje vlastita DNA treba imati..

To su najjednostavniji restrikcijski enzimi jer ne zahtijevaju nikakav kofaktor osim magnezija (Mg +) da prepoznaju i režu DNA sekvence.

Točnost restrikcijskih enzima tipa II u prepoznavanju i rezanju jednostavnih sekvenci u DNA u preciznim pozicijama čini ih jednim od najčešće korištenih i neophodnih u većini grana molekularne biologije.

Unutar skupine restrikcijskih enzima tipa II višestruki su podrazredi klasificirani prema određenim svojstvima koja su jedinstvena za svaku od njih. Klasifikacija ovih enzima vrši se dodavanjem slova abecede, od A do Z, po imenu enzima..

Neki od podklasa koje su najpoznatiji po svojoj korisnosti su:

Podklasa IIA

Oni su dimeri različitih podjedinica. Oni prepoznaju asimetrične sekvence i koriste se kao idealni prekursori za stvaranje enzima za rezanje.

Podklasa IIB

Sastoje se od još jednog dimera i odsijecaju DNK na obje strane sekvence prepoznavanja. Rezali su oba dijela DNA u rasponu parova baza izvan mjesta prepoznavanja.

Podklasa IIC

Enzimi ovog tipa su polipeptidi s funkcijama podjele i modifikacije DNA lanaca. Ovi enzimi su asimetrično rezali obje niti.

Podklasa IIE

Enzimi ovog podrazreda najčešće se koriste u genetskom inženjeringu. Oni imaju katalitičko mjesto i općenito zahtijevaju alosterički efektor. Ovi enzimi trebaju uzajamno djelovati s dvije kopije njihovog slijeda prepoznavanja kako bi učinili učinkovit rez. Unutar ovog podrazreda nalaze se enzimi EcoRII i EcoRI.

Tip III restrikcijski enzimi

Endonukleaze tipa III su sastavljene od samo dvije podjedinice, jedna je odgovorna za prepoznavanje i modifikaciju DNA, dok je druga odgovorna za rezanje sekvence.

Ovi enzimi zahtijevaju dva kofaktora za njihovo funkcioniranje: ATP i magnezij. Restrikcijski enzimi ovog tipa posjeduju dva asimetrična mjesta prepoznavanja, translociraju DNA na način ovisan o ATP-u i izrežu ga između 20 do 30 bp u blizini mjesta prepoznavanja..

Tip IV restrikcijski enzimi

Enzimi tipa IV lako se identificiraju, jer izrezuju DNA s oznakama za metilaciju, oni se sastoje od nekoliko različitih podjedinica koje su odgovorne za prepoznavanje i rezanje DNA slijeda. Ovi enzimi koriste kao kofaktore GTP i dvovalentni magnezij.

Specifična mjesta za rezanje uključuju nukleotidne lance s ostacima metiliranog ili hidroksimetiliranog citozina u jednoj ili oba lanca nukleinskih kiselina.

Tip V restrikcijski enzimi

Ova klasifikacija grupira enzime tipa CRISPER-Cas, koji identificiraju i sijeku specifične sekvence DNA iz organizama koji napadaju. Cas enzimi koriste lanac CRISPER sintetiziranog RNA za prepoznavanje i napadanje organizama koji napadaju.

Enzimi klasificirani kao tip V su polipeptidi strukturirani prema tipovima I, II i II enzima. Oni mogu izrezati dijelove DNA gotovo svakog organizma i sa velikim rasponom duljine. Njihova fleksibilnost i jednostavnost korištenja čine ove enzime jednim od najčešće korištenih alata u genetskom inženjerstvu danas zajedno s enzimima tipa II..

Primjeri

Za detekciju DNA polimorfizama korišteni su restrikcijski enzimi, osobito u istraživanjima populacijske genetike i evolucijskih studija pomoću mitohondrijske DNA, kako bi se dobile informacije o brzinama nukleotidnih supstitucija..

Trenutno, vektori korišteni za transformaciju bakterija s različitim namjenama imaju multiklonaška mjesta gdje se nalaze mjesta prepoznavanja za višestruke restrikcijske enzime..

Među tim enzimima najpopularniji su EcoRI, II, III, IV i V, dobiveni i opisani prvi put. E. coli; HindIII, od H. influenzae i BamHI B. amyloliquefaciens.

reference

  1. Bickle, T.A., & Kruger, D.H. (1993). Biologija restrikcije DNA. Mikrobiološki pregledi, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Pruža stečenu otpornost na viruse u prokariotima. znanost, 315(Ožujak), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Molekularna perspektiva: Restrikcijske endonukleaze. Matične stanice Osnove medicine raka, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Hopping, jumping i petlje pomoću restrikcijskih enzima. Transakcije biokemijskog društva, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Održavanje identiteta vrsta i kontrola speciacije bakterija: nova funkcija sustava ograničavanja / modifikacije? gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., i Kilpatrick, S. (2018). Lewinovi geni XII (12 izd.). Burlington, Massachusetts: Jones i Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Ona, Q. (2015). Upotreba CRISPR-Cas sustava tipa I i III za uređivanje genoma. Nukleinske kiseline istraživanja, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T.F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Tip I restrikcijski enzimi i njihovi srodnici. Nukleinske kiseline istraživanja, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Endonukleaze ograničenja u analizi i restrukturiranju DNA molekula. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., i Tajima, F. (1981). Polimorfizam DNA koji se može detektirati restrikcijskim endonukleazama. genetika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., i Wende, W. (2005). Stanične i molekularne znanosti o životu tip II restrikcijske endonukleaze: struktura i mehanizam. CMLS Stanične i molekularne znanosti o životu, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Kako su restrikcijski enzimi postali nosioci molekularne biologije. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J. i Murray, K. (1976). Restrikcijske endonukleaze. Kritički osvrti u biokemiji, (Studeni), 123-164.
  14.  Stoddard, B.L. (2005). Struktura i funkcija endonukleaze. Tromjesečni pregledi biofizike, 1-47.
  15.  Tock, M.R. & Dryden, D.T.F. (2005). Biologija ograničenja i anti-ograničenja. Aktualno mišljenje u mikrobiologiji, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G. & Murray, N.E. (1991). Sustavi ograničavanja i modifikacije. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomski uvid u virulenciju Campylobacter jejuni i populacijsku genetiku. Zaraziti. Dis. Transl. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktura i mehanizam multifunkcionalnih endonukleaza ograničenja. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.