Temelj, priprema i uporaba bujona za ureu



bujon za ureu je tekući medij za kulturu, korišten za dokazivanje prisutnosti enzima ureaze u određenim mikroorganizmima. Ureaza je mikrobni enzim koji se proizvodi konstitutivno, tj. Sintetizira se neovisno o tome je li supstrat na kojem djeluje prisutan ili ne.

Funkcija ureaze povezana je s razgradnjom organskih spojeva. Nisu svi mikroorganizmi sposobni sintetizirati taj enzim, stoga njegovo određivanje u laboratoriju omogućuje identificiranje određenih bakterijskih sojeva, pa čak i razlikovanje vrsta istog roda..

Postoje dvije vrste testa uree: Stuart i Christensen. Razlikuju se po sastavu i osjetljivosti. Prvi je poseban za prikaz velike količine ureaze proizvedene vrstama roda Proteus.

Drugi je osjetljiviji i može detektirati male količine ureaze nastale kasno od drugih bakterijskih rodova, kao što su Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter i Mycobacterium.

Bujon Stuart urea sastoji se od ureje, natrijevog klorida, dikalijevog fosfata, monokalijevog fosfata, ekstrakta kvasca, fenolnog crvenog i destilirane vode..

Dok se Christensen bujon ili urea od agara sastoji od peptona, natrijevog klorida, monokalijevog fosfata, glukoze, ureje, fenol crvenog, destilirane vode i agar-agara. Potonji samo ako je čvrsti medij.

indeks

  • 1 Temelj
    • 1.1 Buđ Stuart uree
    • 1,2 Christensen bujon ili urea u obliku agara
    • 1.3 Tumačenje oba medija (Stuart i Christensen)
  • 2 Priprema
    • 2.1 Bujon Stuartove ureje
    • 2.2. Christensen bujon ili agar urea
  • 3 Upotreba
  • 4 Sjetva testa ureje
  • 5 Kontrola kvalitete
  • 6 Reference

temelj

Enzim ureaza hidrolizira ureu da nastane ugljični dioksid, voda i dvije molekule amonijaka. Ti spojevi reagiraju tako da tvore konačni produkt koji se zove amonijev karbonat.

Bujon od Stuarta ureje

Bujon iz Stuart uree je više puferiran s pH 6,8. Stoga, mikroorganizam mora biti u stanju formirati velike količine amonijaka da postanu crvene do fenola. PH mora porasti iznad 8.

Stoga je bujon Stuart uree selektivan za vrste Proteus, dajući pozitivne rezultate u 24 do 48 sati inkubacije, i nije učinkovit za bakterije koje proizvode male količine ureaze ili koje polagano hidroliziraju ureu.

To je zato što vrste Proteus mogu koristiti ureu kao izvor dušika. Nasuprot tome, druge bakterije koje proizvode ureazu trebaju dodatni izvor.

Međutim, Pérez i sur. (2002) utvrdili su da je bujon Stuart uree jednako učinkovit kao i urea agar iz Christensena, da bi se odredila ureaza u sojevima kvasaca rodova Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon i Saccharomyces..

Autori studije tvrde da su postigli 100% slučajnosti s oba medija (Stuart i Christensen) inkubiranjem 24 i 48 sati; pod uvjetom da uzmu kao pozitivne sojeve koji su uspjeli pretvoriti medije u jaku ružičasto-fuksijsku boju.

Ovo pojašnjenje je potrebno, budući da je Lodder (1970) potvrdio da gotovo svi kvasci uspijevaju staviti kosinu urea agara Christensena u blijedo ružičastu. To je zbog toga što mogu hidrolizirati ureu u minimalnim količinama, te na formiranje amina oksidativnim dekarboksiliranjem aminokiselina na površini. To se ne smije tumačiti kao pozitivno.

Bujon ili urea agar iz Christensena

Bujon ili agar iz Christensen ureje je manje puferiran, jer je u stanju detektirati male količine amonijaka. Osim toga, ovaj medij obogaćen je peptonima i glukozom. Ovi spojevi uzrokuju razvoj drugih mikroorganizama koji proizvode ureazu i ne rastu u Stuartovoj juhi.

Isto tako, Christensenov test ureje nudi brže rezultate, pogotovo za Proteus, koji može dati jako pozitivan učinak u samo 30 minuta kao minimalno vrijeme i do 6 sati kao maksimalno vrijeme..

Ostatak mikroorganizama koji stvaraju ureazu uspijevaju lagano pretvoriti boju medija nakon 6 sati, a snažno nakon 24, 48, 72 ili više sati, a čak i neki sojevi mogu dati slabe reakcije nakon 5 ili 6 dana.

Tumačenje oba medija (Stuart i Christensen)

Medij je izvorno žuto-narančaste boje, a pozitivna reakcija pretvorit će boju srednjeg u ružičastu-fuksiju. Intenzitet boje je izravno proporcionalan količini proizvedenog amonijaka.

Negativna reakcija će napustiti medij izvorne boje, osim kvasaca, koji mogu dati blijedo ružičastu boju s Christensen urea agara..

priprema

Bujon od Stuarta ureje

Izvagajte potrebne grame prema indikacijama komercijalne kuće. Otopiti u ponajprije sterilnoj destiliranoj vodi. Nemojte koristiti toplinu za otapanje jer je urea osjetljiva na toplinu.

Metoda membranske filtracije koristi se za sterilizaciju. Za to se upotrebljava Millipore filtar s porama promjera 0,45 μ. Nemojte koristiti autoklav. Kada se otopina filtrira, ona se distribuira u sterilne epruvete. Da bi se dobili pouzdani rezultati, mora se prenijeti između 1,5 ml kao minimalna količina do 3 ml kao maksimalna količina po epruveti..

Čuvajte u hladnjaku i držite se prije upotrebe.

Ako metoda filtracije nije dostupna, medij treba odmah koristiti za dobivanje pouzdanih rezultata.

Drugi način za pripremu uree Stuart juha je sljedeći:

Neke komercijalne kuće prodaju pola baze za test ureje, ne uključujući uree.

Iznos koji je naznačila komercijalna kuća izvagana je. Otopi se u destiliranoj vodi i sterilizira u autoklavu na 121 ° C 15 minuta. Neka se malo odmori, a kada je medij topao dodajte 100 ml otopine uree pripremljene po 20% i sterilizirajte filtracijom.

Distribuira se u sterilnim epruvetama, kao što je prethodno opisano.

Bujon ili urea agar iz Christensena

-Priprema otopine uree

Izvaže se 29 grama dehidrirane uree i otopi u 100 ml destilirane vode. Za sterilizaciju upotrijebite metodu filtriranja. Nemojte autoklavirati.

-Agar s bazom uree

24 g dehidriranog baznog agara otopiti u 950 ml destilirane vode. Sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 15 minuta. Pustite stajati dok ne dostigne temperaturu od 50 ° C i aseptički dodajte prethodno pripremljenu ureu.

Ulijte 4 do 5 ml u sterilne epruvete i nagnite dok se ne skrutne. Trebao bi postojati dugi vrh flaute.

Ovaj medij se također može pripraviti u tekućem obliku.

aplikacije

Test ureje je izuzetno učinkovit u razlikovanju roda Proteus od drugih rodova obitelji Enterobacteriaceae, s obzirom na brzu reakciju koju pruža Proteus.

Ako se koristi sastav Christensena, test pomaže razlikovati vrste iste vrste. Na primjer, S. haemolyticus i S. warneri sna Staphylococcus koagulaza negativno i betahemolitičko, ali se u tome razlikuju S. haemolyticus to je negativna urea i S. warneri to je pozitivna urea.

S druge strane, McNulty je uspješno upotrijebio 2% Christensen uree za proučavanje prisutnosti Helicobacter pylori u uzorcima biopsija uzetih iz sluznice želuca (antralna regija).

Prisutnost H. pylori to se dokazuje pozitivnim testom uree. Trajanje promatranja rezultata izravno je proporcionalno količini prisutnih mikroorganizama.

Kao što se može vidjeti, to je jednostavna metoda za dijagnosticiranje Helicobacter pylori u biopsijama želuca.

Konačno, ovaj test je također koristan za razlikovanje vrsta roda Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus i Mycobacteria.

Sjetva testa ureje

Ove dvije metode zahtijevaju snažan mikrobni inokulum za optimiziranje rezultata. Bakterijske kolonije se preferirano uzimaju iz krvnog agara i Sabouraud agar kvasaca, uz neke iznimke. Inokulum se emulgira u tekućem mediju.

Za bujon Stuartove ureje inkubiran na 37 ° C 24 do 48 sati, znajući da se traži samo sojeve roda Proteus kada je soj bakterija. Za kvasce može se inkubirati na 37 ° C ili na sobnoj temperaturi tijekom 24 do 48 sati inkubacije.

U slučaju bujona Christensen ureje, inkubirajte na 37 ° C 24 sata. Ako je test negativan, može se inkubirati do 6 dana. Ako je test pozitivan prije 6 sati, to znači da je to soj roda Proteus.

U slučaju Christensen urea agara, agar kosina se jako inokulira, bez probijanja. Bujon se inkubira i interpretira na isti način.

Kontrola kvalitete

Kontrolni sojevi mogu se koristiti za testiranje medija, kao što su Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 i Salmonella typhimurium.  Prva dva moraju dati pozitivne rezultate i posljednja dva negativna rezultata.

reference

  1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. i sur. Upotreba bujona za ureju Stuart za ureazni test, kao test u dijagnostici kvasaca. Rev. Soc. Microhiol. 2002; 22 (2): 136-140. Dostupno na: Scielo.org.
  2. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testovi za identifikaciju bakterija od kliničkog značaja. 3. izd. Uvodnik Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  5. Laboratories Britania. Christensen Medio (baza agar urea) 2015. Dostupno na: britanialab.com