Karakteristike i priprema bakterijskog razmaza
bakterijski razmaz je proširenje u obliku tankog filma suspenzije bakterijskih mikroorganizama koje se provodi na prozirnoj staklenoj ploči ili pločicama, za promatranje pod optičkim mikroskopom.
Proširenje u obliku filma provodi se kako bi se mikroorganizmi što više odvojili, jer ako su grupirani, promatranje nije jasno..
U proučavanju kultura bakterija korištene su tehnike priprave razmaza, fiksacije i obojenja za bolju analizu. Zbog male veličine mikroorganizama, uporaba optičkog mikroskopa nužno je potrebna za njegovo promatranje.
Optički mikroskopi su neophodni instrumenti za promatranje razmaza. Oni koriste optičke leće i svjetlo koje omogućuje vizualizaciju uzoraka s velikim povećanjem veličine.
Općenito, žive stanice nemaju strukture koje su uglavnom obojene, gledane kroz optički mikroskop, one su bezbojne, prozirne uzorke, i pokazuju vrlo malo unutarnjeg kontrasta i sa svojom okolinom.
Promatranje s jednostavnim mikroskopom svjetlosnog polja, bez upotrebe pomoćnih tehnika bojenja, vrlo je ograničeno i koristi se samo u nekim slučajevima, kao u promatranju kretanja mikroorganizama..
Da bi se optimalno promatrali mikroorganizmi, mora se postići ravnoteža između kontrasta i rezolucije. Pojedinosti o stanicama ne mogu se promatrati pod mikroskopom, čak i pri visokoj rezoluciji; upotreba boja je potrebna kroz tehnike bojanja, koje osiguravaju kontrast za promatranje.
indeks
- 1 Značajke kvalitetnog bakterijskog razmaza
- 1.1 Izvrstan kontrast
- 1.2 Dobro rješenje
- 1.3 Dobro bojenje
- 2 Priprema
- 2.1 A. Frotis
- 2.2 Fiksiranje
- 2.3 C. Jednostavno bojenje
- 2.4 D. Definitivno očuvanje razmaza
- 3 Reference
Značajke kvalitetnog bakterijskog razmaza
Izvrstan kontrast
Za postizanje izvrsnog kontrasta nazivaju se sofisticirani mikroskopi mikroskop za fazni kontrast, diferencijalnu interferenciju i mikroskop s tamnim poljem. Ova vrsta mikroskopa koristi se za promatranje bakterijskih struktura, kao što su omoti i filamenti, među ostalima.
Bojenje je jednostavna tehnika za povećanje kontrasta koja se postiže jasnim mikroskopom. U ovoj se tehnici mogu koristiti različite boje koje značajno poboljšavaju promatranje pod mikroskopom.
Mrlje se izrađuju izravno na razmazima ili produžetcima suspenzija mikroorganizama na pločicama, prethodno osušene i fiksirane.
Dobro popraviti
Fiksacija je tehnika koja se koristi za očuvanje staničnih struktura; uzrokuje inaktivaciju mikroorganizama i prianjanje na staklo slajda. Postoje različiti tretmani fiksacije: fiksacija topline i kemijska fiksacija.
Fiksiranje topline
To je metoda koja se najviše koristi u promatranju bakterijskog razmaza. Tehnika se sastoji od propuštanja bakterijske suspenzije razmaza plamenom upaljača. Ova tehnika može sačuvati vanjsku morfologiju bakterija, ali uništava njihove unutarnje strukture.
Kemijska fiksacija
Kemijska fiksacija koristi kemikalije u konzerviranju, kao što su formaldehid ili formaldehid, etanol i octena kiselina, među ostalima. Prednost upotrebe kemijskih sredstava za fiksiranje je da se postigne očuvanje unutarnjih staničnih struktura mikroorganizama.
Dobro bojenje
Najčešći postupci za bojenje prethodno isušenog i fiksiranog razmaza su pozitivno ili jednostavno bojenje, diferencijalno bojanje i negativno bojenje. Postoje i posebne tehnike za bojenje pojedinih staničnih struktura (kapsula, spora, flagela).
Pozitivno bojenje ili jednostavno bojanje
Pozitivna ili jednostavna boja je najčešće korištena tehnika za razmazivanje mrlja. Koristi boje koje imaju sposobnost vezanja za određene mikrobne strukture, dopuštajući im da ih se promatra pod mikroskopom.
Ove boje imaju kromoforne skupine (obojeni dio) u svojoj kemijskoj strukturi, s naizmjeničnim dvostrukim vezama i jednostavnim vezama (konjugacijom). Ove veze mogu opet uspostaviti ionske ili kovalentne veze s nekim staničnim strukturama.
Boje koje se koriste u pozitivnom ili jednostavnom bojanju uglavnom su kemijski derivati anilin (obojene organske soli).
S druge strane, među bojama možemo naći neke s osnovnim pH, a druge s kiselim pH.
Osnovna bojila
U osnovnim bojama, kromoforska skupina ima pozitivan električni naboj. Velika većina prokariotskih mikroorganizama ima neutralni unutarnji pH, a njihova stanična površina je negativno nabijena. Kroz ovu elektrostatičku interakciju, kromofor se veže na stanicu i oboji je.
Primjeri osnovnih bojila su metilensko plavo, ljubičasti kristali, malahitno zeleni, bazični fuscin, safranin, između ostalih.
Kisele boje
U kiselim bojama kromoforska skupina ima negativni električni naboj. Oni se koriste za bojenje proteina s pozitivno nabijenim amino skupinama. Primjeri kiselih boja su kiseline fuscin, ruža Bengal, Congo crvena i eozin.
Diferencijalno bojenje
Tehnika različitog bojenja sastoji se od primjene dvije boje različitih boja ili intenziteta, kako bi se razlikovali različiti mikroorganizmi pod mikroskopom. Obojenje po Gramu i kiselinsko-alkoholna otpornost su najčešće korištene diferencijalne mrlje u bakteriologiji.
Gram boja se koristi kao preliminarni test za poznavanje oblika, veličine, grupiranja stanica, pored vrste stanične stijenke. Kroz Gram test na boju, bakterije sa staničnom stijenkom klasificirane su kao Gram-pozitivne bakterije i Gram-negativne bakterije.
Negativno bojenje
U ovoj tehnici koriste se kemijske boje koje ne prodiru u staničnu unutrašnjost, ali to čine medij u kojem se mikroorganizmi pojavljuju kao crna pozadina..
U tehnici negativnog bojenja, razmaz se radi s kapljicom suspenzije kineske tinte ili nigrozina, koja nakon sušenja na sobnoj temperaturi stvara film neproziran za prolaz svjetlosti. Na taj se način mikroorganizmi promatraju kao svijetle forme na tamnoj pozadini.
priprema
A. Bris
1.- Dobro operite stakalca, osušite upijajući papir i označite ih. Oznaka mora sadržavati sadržaj pripreme, datum i ime osobe koja ga je obradila.
2. - Osvijetlite upaljač i sterilizirajte petlju za inokulaciju u plamenu dok se ne zagrije.
3.- Ostavite ručku hladnom.
4.- Uzmite epruvetu bakterijske kulture, uklonite poklopac i brzo prođite kroz otvor cijevi blizu plamena upaljača (plamen)..
5. Uvesti cijev za inokulaciju unutar epruvete koja sadrži bakterijsku kulturu i uzeti uzorak.
6. Ako je kultura u tekućem mediju, stavite uzorak uzet s drškom u središte klizača i pažljivo ga rasprostrite u krugu promjera približno 2 cm.
7.- Ponovno sterilizirajte petlju za inokulaciju.
8.- Dopustite sušenje razmaza u zraku.
9.- Ponovite korake 3 do 8 tri puta.
10. Ako je kultura u krutom mediju, kapljicu destilirane vode treba prethodno staviti na klizač. To je učinjeno kako bi se pomiješao mali uzorak kulture uzet s drškom inokulacije, prema indikacijama koraka 2 do 5 (uvjeti asepse).
11.- Izvucite razrijeđeni uzorak s kapljicom vode na klizač i ponovite tri puta.
B. Učvršćivanje
1.- Dodajte suhim razmazima proizvedenim iz kultura u tekućem mediju, dvije kapi metanola ili apsolutni etanol.
2.- Dopustite sušenje u zraku od upaljača.
3. Ako bris dolazi iz kulture u čvrstom mediju, suhi razmaz se fiksira toplinom, prolazi 2 do 3 puta brzo kroz najtopliji dio plamena upaljača..
4. - Dodirnite donji dio brisa dorzalnim dijelom lijeve ruke (za desnu ruku, inače koristite desnu ruku) i provjerite je li hladno.
C. Jednostavno bojenje
1. Dodajte 2 kapi odabrane boje u razmaz i ostavite da djeluje u vremenu potrebnom za specifične protokole svake boje (obično između 1 i 5 minuta).
Neke boje zahtijevaju korištenje topline za njihovo aktiviranje, pri čemu je potrebno biti vrlo oprezan pri zagrijavanju klizača u plamenu upaljača (manipulirati ga pincetom i izbjegavati vrenje). Pregrijavanje razmaza može uništiti stanice koje želite promatrati.
3.- Uklonite višak boje pranjem destiliranom vodom iz pikete. Uklonite vodu za pranje laganim kuckanjem klizača po rubu, nagnutom na radni stol.
4.- Dopustite sušenje zraka.
5.- Ovisno o vrsti promatranja, u ovoj se fazi koristi pokrivač. Pokrivač štiti i čuva razmaz. Ako se u ovom stadiju vrši uvid u uranjanje u ulje, ne koristi se pokrovni list, ali se razmaz ne može sačuvati.
D. Definitivno očuvanje razmaza
1.- Potopite razmaz sukcesivno u svaku od dolje navedenih otopina, najmanje 5 minuta. Svrha ovih "kupki" je ostaviti razmaz potpuno dehidriran. Svaki reagens se mora isušiti prije uvođenja razmaza u sljedeću kupku.
Redoslijed kupki za sušenje je sljedeći:
- Etanol 70%
- 95% etanol
- Čisti aceton
- Miješati aceton-ksilol 1: 1
- ksilen
Zatim dopustite sušenje zraka.
2. Montirajte pokrivač, po mogućnosti 22 × 22 mm, koristeći kanadski balzam ili druga sredstva za sklapanje.
reference
- Briggs, G. (1965). Uzročni čimbenici u mikrobiološkim laboratorijskim nesrećama i infekcijama. Biološke laboratorije američke vojske. Fort Detrick.
- Cappucino, J.G. i Welch, C.T. (2017). Mikrobiologija: priručnik za laboratorij. Pearson.
- Holt, J.G. Urednik. (1977). Kraći Bergeyjev priručnik o determinativnoj bakteriologiji. 8th Baltimore: The Williams i Wilkins Co.
- Johnson, T.R. i Case; CL (2018.). Laboratorijski pokusi u mikrobiologiji. Pearson.
- Tille, P. (2017). Dijagnostička mikrobiologija. 14th St. Louis, SAD: Elsiever, Inc..