DNA sekvenciranje Maxam-Gilbert, Sanger metoda, primjeri



DNA sekvenciranje (deoksiribonukleinska kiselina) je postupak koji se provodi u laboratorijima molekularne biologije koji omogućuje poznavanje redoslijeda nukleotida u genetskom materijalu koji je od interesa. Osim toga, može se otkriti i sekvenciranje RNA (ribonukleinske kiseline).

Ova tehnika je neophodna za razvoj bioloških znanosti. Primjenjivo je i na druga područja znanja - kao što su medicinska dijagnoza i forenzička ispitivanja, na primjer.

Prethodno je sekvenciranje lanca DNA smatrano sporom i skupom aktivnošću, što je omogućilo identifikaciju samo nekoliko parova baza u oligonukleotidima.

Danas, uz sva dostignuća znanosti, DNA sekvenciranje je rutinska operacija u mnogim laboratorijima širom svijeta zahvaljujući doprinosu od gotovo 50 godina istraživanja u ovom području. Što se tiče duljine lanca, u vrlo kratkom vremenu možete sekvencirati do milijuna baznih parova.

Da biste to učinili, razvijeno je na desetke tehnika koje se razlikuju po cijeni i točnosti. U ovom ćemo članku opisati klasične i moderne tehnike, svaka sa svojim prednostima i nedostacima.

Do sada, tehnike sekvenciranja omogućuju dobivanje sekvence potpunih genoma, od malih prokariota i kvasaca do ljudskog genoma.

indeks

  • 1 Struktura DNA
  • 2 Povijest
  • 3 Sanger metoda
    • 3.1 Glavne komponente reakcije
    • 3.2 Čitanje rezultata
  • 4 Automatsko sekvenciranje
  • 5 Maxam-Gilbertov redoslijed
    • 5.1 Postupak
    • 5.2 Čitanje rezultata
  • 6 Masivno sekvenciranje
    • 6.1
    • Sekvenciranje sintezom
    • 6.3
    • 6.4 Redoslijed Ion Torrent
  • 7 Primjeri
    • 7.1. Sekvenciranje ljudskog genoma
  • 8 Važnost i primjene
  • 9 Reference

Struktura DNA

Da bi se razumjele metode i tehnike koje se koriste za sekvenciranje DNA, potrebno je znati određene ključne aspekte strukture i sastava molekule..

DNA je biomolekula koja se nalazi u svim živim bićima, od bakterija do velikih vodenih životinja. Organele - poput mitohondrija i kloroplasta - imaju kružnu molekulu DNA unutar njih. Čak iu nekim virusima pronađeni genetski materijal je DNA.

Strukturno, DNA je skup nukleotida. Svaka je integrirana pomoću ugljikohidrata, dušične baze (A, T, C ili G) i fosfatne skupine. Cilj sekvenciranja DNA je otkriti redoslijed u kojem se nalaze četiri dušične baze u nizu.

povijest

Sredinom pedesetih godina prošlog stoljeća istraživači Watson i Crick opisali su strukturu DNA pomoću kristoloških tehnika. Međutim, nitko od tih istraživača nije uspio pronaći način da otkrije slijed.

Iako su postojali određeni prethodnici, najvažniji događaj bio je stvaranje Sanger-ove metode, 1977. Frederick Sanger, otac metode, bio je britanski biokemičar, dobitnik dvije Nobelove nagrade za ogromne doprinose biološkim znanostima..

Ova tehnika je također poznata u literaturi kao "kraj lanca" ili dideoksinukleotidi. U nastavku ćemo opisati principe ove tehnike i one koje su razvijene na temelju toga poboljšanja i inovacije.

Sanger-ova metoda

Razvoj Sanger-ove metode predstavljao je ključni događaj u molekularnoj biologiji. Uključuje osnovne komponente procesa replikacije DNA koje se normalno odvijaju u ćeliji, ali dodavanjem posebne komponente: dideoksinukleotidi.

Glavne komponente reakcije

- DNA polimeraza: enzimski DNA polimeraza je ključni element procesa. Ova molekula sudjeluje u replikaciji lanca DNA i njegova uloga je sinteza novog lanca, što odgovara deoksiribonukleotidima trifosfata s komplementarnim.

Zapamtite da su u DNK timin (T) upareni s adeninima (A) pomoću dvije vodikove veze, dok citozin (C) radi s gvaninom (G) s tri mosta.

- Nukleotidi: Sanger sekvenciranje uključuje dva tipa nukleotida, četiri 2'-deoksinukleotida (skraćeno dATP, dGTP, dCTP i dTTP) i četiri dideoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP).

Iako su dideoksinukleotidi slični monomerima koji su normalno ugrađeni u DNA, u njihovoj strukturi nedostaje -OH skupina. To onemogućuje dodavanje novog nukleotida u lanac.

Stoga, kada se doda poseban nukleotid - na potpuno slučajan način - u lanac u formaciji, sinteza je paralizirana. Na taj način, na kraju reakcije, postoje lanci različitih veličina, gdje je reakcija zaustavljena na različitoj točki.

Eksperimentalno, pripremljena su četiri pokusa. Svaka sadrži DNK ekstrahiranu iz biološkog uzorka od interesa, normalne nukleotide i jedan od četiri tipa posebnih nukleotida. Ili su posebni nukleotidi označeni nekim tipom fluorescentnog markera (vidi niže automatizirano sekvenciranje).

Čitanje rezultata

Prvi korak je odvajanje svakog od sintetiziranih lanaca prema njihovoj veličini. Neki će biti dulji od drugih, ovisno o tome gdje su ugrađene posebne baze.

Postoje različite biokemijske tehnike koje omogućuju odvajanje komponenti smjese upotrebom veličine kao diskriminatornog svojstva. U Sanger metodi, različiti lanci su odvojeni elektroforezom. U najsofisticiranijim varijantama tehnike koristi se kapilarna elektroforeza.

Tako se dulji pramenovi kreću manje od kraćih varijanti. Zatim, ovaj sustav prolazi kroz čitač koji prepoznaje marker uključen u svaki dideoksinukleotid. Na taj način, redoslijed sekvenci može biti poznat.

Ova tehnika "prve generacije" može čitati fragmente DNA ne veće od 1 kilobaza. Trenutno se Sanger-ova metoda koristi u nekoliko laboratorija, općenito u modernim varijantama. Osim toga, koristi se za potvrđivanje rezultata dobivenih najsloženijim tehnikama - ali manje preciznim.

Automatsko sekvenciranje

Kada je potrebno opsežno sekvenciranje, proces se ubrzava automatizacijom. Ovo je varijanta Sanger metode završetka lanca, gdje su prajmeri označeni fluorescentnim proizvodima kako bi ih se razlikovalo..

Nakon toga, reakcija se odvija u elektroforezi - sve u jednoj traci. Kada svaki fragment napusti konačni dio gela, brzo se identificira svojom fluorescentnom oznakom, s pogreškom koja okružuje 1%.

Najsofisticiraniji sustavi imaju sustav do 96 kapilarnih cijevi kojima upravlja računalo povezano s robotom. To jest, 96 uzoraka DNA može se procijeniti istovremeno. Stoga je proces koji uključuje elektroforezu i analizu rezultata potpuno automatiziran.

U jednom danu, ovi sustavi mogu slijediti do 550.000 baza. Tijekom procesa, ljudski rad je nepotreban, potrebno je samo 15 minuta za početak metode.

Redoslijed Maxam-Gilberta

U isto vrijeme kada je Sanger objavio svoj rad, dvojica istraživača Allan Maxan i Walter Gilbert uspjeli su razviti drugu metodu za dobivanje DNA slijeda. Metoda je dobila popularnost u to vrijeme, ali je kasnije zamijenjena poboljšanjem Sanger-ove metode.

Suprotno Sanger-ovoj metodi, sekvenciranje Maxana i Gilberta (ili kemijsko sekvenciranje, kao što je također poznato) ne uključuje hibridizacijske reakcije. Metodologija se sastoji od označavanja s reaktivnim sredstvima na jednom kraju, nakon čega slijedi postupak pročišćavanja.

Jedan od negativnih aspekata ove tehnike leži u njezinoj ogromnoj složenosti i korištenju kemikalija koje su opasne za korisnika. Kemijske razgradnje induciraju se primjenom DMS, mravlje kiseline, hidrazina i hidrazina sa solima.

proces

Protokol započinje označavanjem na 5 'kraju trake s fosfornim markerom 32, zatim dolazi do kemijske modifikacije dušične baze i ona se razdvaja. Konačno dolazi do cijepanja abasične regije.

Prvo se lanac koji treba sekvencionirati skraćuje na manje segmente. Ovaj korak se izvodi s restrikcijskim enzimima, koji rezultiraju iznimnim ekstremima.

Zatim se reakcija provodi s alkalnom fosfatazom, čija je svrha eliminiranje fosfatne skupine. Prema tome, polinukleotidna kinaza se može koristiti za obavljanje označavanja.

Lanac je denaturiran (dva pramenova otvorena). Zatim nastavljamo primjenjivati ​​kemikalije. Ove reakcije cijepanja se provode na kontrolirani način i koje vrste veza se prekidaju pomoću svake primijenjene kemikalije.

Čitanje rezultata

Kao i kod Sanger metode, očitavanje rezultata uključuje razdvajanje lanaca dobivenih u sustavu elektroforeze. Sustavi sastavljeni od poliakrilamida omogućuju dobivanje vrlo odgovarajuće razlučivosti za čitanje gela.

Masivno sekvenciranje

Masivno sekvenciranje obuhvaća niz novih metoda, skraćeno NGS, s engleskog "Redoslijed sljedeće generacije ".

Metode katalogizirane kao NGS zahtijevaju prethodni korak amplifikacije DNA (ne rade s jednom molekulom). Osim toga, korištene platforme uvelike variraju. Principi najpopularnijih metoda bit će opisani u nastavku:

pyrosequencing

To uključuje praćenje oslobađanja pirofosfata, koji se pojavljuje svaki put kada se novi nukleotid doda u lanac DNA. Enzimski sustav je povezan, tako da se emisija svjetlosti (koja se može detektirati fotoaparatom) pojavljuje svaki put kad se ugradi novi nukleotid.

Postupak započinje s odvojenom inkubacijom svake dušične baze kako bi se provjerilo postoji li emisija svjetlosti ili ne. Pirosekvenciranje može provesti čitanje dugih niti, ali je pronađena stopa pogreške visoka.

Sekvenciranje sintezom

To uključuje ugradnju obilježenih nukleotida. Ove fluorescentne komponente se dodaju, isperu i uočava se ugrađeni nukleotid. Tada se nukleotidno obilježavanje eliminira i sinteza lanca se može nastaviti. U sljedećem koraku će također biti uključen obilježeni nukleotid, a spomenuti koraci će se ponoviti.

Jedan nedostatak ove tehnike se javlja kada fluorescentni markeri nisu potpuno eliminirani. Te emisije stvaraju pozadinske pogreške, što rezultira značajnim pogreškama.

Redoslijed ligacijom

Ova tehnika varira od drugih, jer ne koristi DNA polimerazu. Umjesto toga, ključni enzim za ovu metodologiju je ligaza. Ovdje se koriste fragmenti DNA fluorescentno obilježeni, vezani enzimom i detektirani.

Najveći problem s ovom tehnikom je vrlo kratka duljina fragmenta koji je sposoban za obradu.

Ion Sequencing Torrent

Ova tehnika se temelji na mjerenju H iona+ koji se oslobađa svaki put kada se ugradi novi nukleotid. Princip je vrlo sličan pirosekvenciranju, ali mnogo jeftiniji.

Primjeri

Sekvenciranje ljudskog genoma

Sekvenciranje genoma ljudi bilo je jedan od najvećih izazova u biologiji, kao i jedan od najcjenjenijih rivalstava u povijesti znanosti. Zapravo, za znanstvenike uključene u projekt, sekvenciranje genoma je postalo natjecanje.

Godine 1990. pokrenuo je takozvani "projekt ljudskog genoma", na čelu s poznatim znanstvenikom, dobitnikom Nobelove nagrade, Jamesom Watsonom. Nakon godinu dana, 1991., Venter preuzima izazov "premlaćivanja" Watsona i određivanja genoma prije njega. Međutim, godine 1992. Watson se povukao i zapovjedništvo je preuzeo drugi istraživač.

Godine 1995. Venter je najavio svoj uspjeh u kompletnom sekvenciranju bakterijskog genoma metodom slučajnog sekvenciranja. Isto tako, suprotni tim je godinu dana kasnije objavio sekvenciranje genoma kvasca.

Godine 2000. rasa je prekinuta. Obje tvrtke objavile su svoje preliminarne rezultate kompletnog genoma u dva najprestižnija znanstvena časopisa: priroda i znanost.

Međutim, znanstvenici su nastavili raditi na poboljšanju prijedloga, a 2006. godine sekvence su dovršene određenim ljudskim kromosomima.

Važnost i primjene

Poznavanje redoslijeda nukleotida molekule jednako važno kao i DNA vrijedno je za biologe i srodne stručnjake. Ovaj lanac polinukleotida sadrži sve informacije potrebne za razvoj i održavanje svih oblika života.

Zbog toga je poznavanje tog slijeda neophodno za biološka istraživanja. U osnovi, sekvenciranje nam omogućuje da izmjerimo jedno od najvažnijih svojstava bioloških sustava i utvrdimo razlike između njih.

Sekvenciranje je široko korišteno od strane taksonomista i sistematista, budući da određeni DNA sljedovi omogućuju utvrđivanje kriterija za zaključivanje da li dva organizma pripadaju istoj vrsti ili ne, te da mogu predložiti hipoteze o filogenetskim odnosima između njih..

Osim toga, DNA sekvenciranje ima primjene u području medicine i dijagnostike. Na primjer, postoje pristupačni i pristupačni sustavi koji, pomoću sekvenciranja, omogućuju nam da procijenimo tendenciju razvoja određenih bolesti (kao što je rak) pomoću takozvanih jednostavnih nukleotidnih polimorfizama (SNP)..

Istraživanja kriminalističkog i forenzičkog tipa također su obogaćena tehnikama sekvenciranja i mogu se koristiti kao pouzdani dokazi o sudjelovanju određenog pojedinca u zločinu..

reference

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Slijed sekvencera: povijest sekvencioniranja DNA. genomika, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Sljedeća generacija revolucije sekvenciranja i njezin utjecaj na genomiku. ćelija, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Znanstvena suparništva. Od Galilea do projekta ljudskog genoma. Paraninfo Editorial.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). DNA sekvenciranje s inhibitorima koji završavaju lancem. Zbornik radova Nacionalne akademije znanosti, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S.C. (2007). Sekvenciranje sljedeće generacije pretvara današnju biologiju. Prirodne metode, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (ur.). (2014). Redoslijed sljedeće generacije. Caister Academic Press.