Temelj, priprema i uporaba Voges-Proskauer testa



Voges-Proskauer test je biokemijski test koji se koristi za identifikaciju bakterija koje pripadaju obitelji Enterobacteriaceae. Posebno je korisno razlikovati sojeve Escherichia coli od Klebsiella i Enterobacter, među ostalima.

Test se provodi u tekućem mediju za kulturu koji se naziva metil red-Voges Proskauer, poznatiji pod akronimom RM / VP. Ovaj medij se sastoji od puferiranog polipeptona, glukoze, dikalijevog fosfata i destilirane vode.

Trenutni RM / VP medij je modifikacija Clark i Lubs medija, koji je izvorno sadržavao nižu koncentraciju peptona i glukoze. Stoga je proizveden manji vodikov ion, potreban za pozitivnu Voges-Proskauer reakciju.

Test se temelji na sposobnosti mikroorganizma da koristi glukozu putem smjese butilen glikola i formira neutralni krajnji produkt zvan acetoin, u prisutnosti kisika i alkalnog pH..

U mediju RM / VP, osim što je u stanju otkriti Voges-Proskauer test, test metil metil crvenog može se otkriti.

indeks

  • 1 Temelj
    • 1.1 Osnova Voges-Proskauer testa
    • 1.2 Osnova za razvoj testa i tumačenje
  • 2 Priprema
    • 2.1 Srednji RM / VP
    • 2.2 Voges reagens
    • 2.3 Voges B Reagens
  • 3 Postupak Voges-Proskauer testa
    • 3.1 Razvoj testa
  • 4 Upotrijebite
  • 5 Kontrola kvalitete
  • 6 Reference

temelj

Osnova Voges-Proskauer testa

Pluripeptonas prisutan u mediju osigurava prehrambene potrebe neophodne za rast bakterija. Sa svoje strane, glukoza je glavni spoj. Mnoge bakterije imaju sposobnost metaboliziranja glukoze i formiranja piruvične kiseline.

Piruvična kiselina je središnja točka u metabolizmu glukoze i odatle svaki mikroorganizam može uzeti različite putove. Neki će tvoriti miješane kiseline, kao što su mliječna kiselina, octena kiselina, mravlja kiselina i jantarna kiselina, a druge će tvoriti neutralne proizvode kao što je 2,3-butandiol.

Voges-Proskauer test otkriva sposobnost mikroorganizma da formira acetil metil karbinol (acetoin), međuproizvod 2,3-butandiola u aerobnim uvjetima.

Acetoin se reducira i tvori 2,3-butandiol, ali ova reakcija je reverzibilna, tako da ako se 2,3-butandiol oksidira, nastaje acetoin. Stoga je kisik bitan.

Dikalijev fosfat je pufer koji prigušuje smjesu pri pH 6,9 ± 0,2..

Osnova za razvoj testa i interpretaciju

Da bi se pokazala reakcija, razvoj se mora provesti pomoću dva reagensa (Barrit reagensi), poznatih kao Voges A i Voges B.

Voges A je 5% -tna otopina a-naftola, a Voges B je 40% -tna priprema kalijevog hidroksida. Ako kalijev hidroksid nije dostupan, može ga se zamijeniti s 40% natrijevim hidroksidom.

Α-naftol je katalizator koji će povećati intenzitet boje reakcije, što čini test osjetljivijim. A-naftol se uvijek mora prvo dodati, miješajući cijev tako da medij dolazi u kontakt s kisikom. Na taj način prisutni acetoin se oksidira u diacetil, a 2,3-butandiol se oksidira kako bi nastao acetoin, prenoseći ga u diacetil..

Tako će se α-naftol vezati za diacetil, koji je pak povezan s gvanidinskom jezgrom prisutnom u aminokiselini argininu, koja potječe iz pluripeptonas.

Sa svoje strane, kalij ili natrijev hidroksid je odgovoran za apsorpciju CO2 i reagiraju s peptonima. Ova reakcija uzrokuje nastanak ružičasto-lososove boje, jasno vidljive nakon što se cijev dobro protrese.

Da bi se trenutno pojavila obojenost, moraju se miješati ispravne količine diacetila, peptona i a-naftola. Ako se to ne dogodi, pustite da se cijev odmori 15 minuta prije interpretacije.

Obično je test pozitivan nakon 2 do 5 minuta, kada se može uočiti slaba ružičasta boja. Ako ostavite u mirovanju 30 min do 1 sat, intenzitet boje će biti maksimalan (tamno crvena).

Negativan test bit će vidljiv kada je juha žuta. Nakon 1 sata, ako je test negativan, može nastati bakrena boja kao rezultat reakcije kalijevog hidroksida na α-naftol..

priprema

Srednji RM / VP

Izvaže se 17 g dehidriranog medija kulture i otopi u jednoj litri destilirane vode. Ostavite stajati 5 minuta. Zagrijte do vrenja da biste se potpuno otopili. Poslužite 3 do 4 ml u epruvete i sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 15 minuta.

Dehidrirani medij za kulturu je bež, a pripremljeni medij je svijetlo jantar.

Konačni pH medija je 6,9 ​​± 0,2.

Pomiče reagens

Odvagati 5 g α-naftola i otopiti u 50 ml etilnog alkohola (apsolutno). Nakon toga nastavite s dodavanjem etilnog alkohola do 100 ml.

Reagens Voges B

Izvaže se 40 g kalijevog hidroksida i otopi se u 50 ml destilirane vode u čaši. Staklo treba staviti u hladnu vodenu kupku za kontrolu temperature, jer se u vrijeme otapanja priprema naglo povećava.

Nakon što se otopina ohladi, ona se prenese u stupnjevani balon i dovede se do 100 ml destiliranom vodom.

Postupak Voges-Proskauer testa

Za izvođenje Voges-Proskauer testa, RM / VP bujon se inokulira mikroorganizmom koji se ispituje, od čiste kulture od 18 do 24 sata.

Inokulum ne smije biti previše gust. Inkubira se na 35-37 ° C 24 do 48 sati, iako je ponekad potrebno nekoliko dana inkubacije. Cowan i Steel vjeruju da je 5 dana minimalno vrijeme inkubacije potrebno za otkrivanje svih pozitivnih Voges-Proskauer (VP) vrsta iz obitelji Enterobacteriaceae.

Razvoj testa

Odvojite alikvot od 1 ml u epruvetu i provedite razvoj na sljedeći način: stavite 12 kapi (0,6 ml) Voges A reagensa i 4 kapi (0,2 ml) Voges B. Pomiješajte kako biste aerirali i ostavili stalak 5 - 10 minuta prije izvođenja. Međutim, ako je test još uvijek negativan, neka stoji i promatra cijev nakon 30 minuta do 1 sat.

Pojava ružičasto-crvene boje pokazuje da je reakcija Voges-Proskauer pozitivna. Ako medij ostaje žut, reakcija je negativna.

Dodavanje developera u navedenom redoslijedu i količini ključno je za izbjegavanje pogrešnih negativnih rezultata.

upotreba

Voges-Proskauer test je koristan za razlikovanje sojeva E. coli koji su VP negativni, rodova Klebsiella, Enterobacter, Serratia, među kojima su VP pozitivni.

Kontrola kvalitete

Kontrolni sojevi mogu se koristiti za ispitivanje kvalitete pripremljenog medija. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium i Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Očekivani rezultati su pozitivni za Voges-Proskauer reakcije K. pneumoniae i E. cloacae. Ostali daju negativne reakcije.

reference

  1. Laboratories Britania. MR-VP Medium. 2015. Dostupno na: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Dostupno: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biokemijski testovi za identifikaciju bakterija od kliničkog značaja. 3. izd. Uvodnik Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.