Agar ima standardnu ​​podlogu, pripremu i uporabu

standardni račun agara To je čvrsta srednje, neselektivni, dizajniran za kvantifikaciju mikroorganizama prisutnih u uzorcima vode aerobik potrošnje, otpadne vode, napitaka i drugih namirnica. To znači da je također poznat kao agar PCA, po svojoj akronim na engleskom Plate Count Agar. Nastao je 1953. Buchbinder, Barış i Goldstein.

Standardni račun za agar sastavljen je od ekstrakta kvasca, glukoze, agara i destilirane vode. Ova formulacija sadrži osnovne nutritivne elemente koji omogućuju razvoj sadašnjeg aerobnog mikrobiološkog opterećenja, ne zahtijevajući.

Budući da medij ne sadrži inhibitore, bakterije se mogu razviti bez ikakvih ograničenja, pa je stoga idealan za opći broj kolonija. Međutim, tehnika kvantifikacije ploča neće detektirati sve prisutne bakterije, već samo one koje su sposobne za uzgoj pod uvjetima okoline kojima je podvrgnut standardni sjetveni agar..

Ovdje, kvantizacije tehnika ploča želi utvrditi općenito količina bakterija tipa mezofilne aerobni, odnosno koji se provode pri temperaturama između 25 i 40 ° C, uz optimalne temperature za uzgoj na 37 ° C.

Ova bakterijska skupina je vrlo važna, jer postoji većina patogenih bakterija za čovjeka.

Treba napomenuti da je ponekad zanimljivo kvantificirati količinu psihrofilnih bakterija prisutnih u hrani. Ove bakterije su one koje se razvijaju na niskim temperaturama (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Isto tako, termofilne bakterije, koje se razvijaju u rasponu od 50 ° C do 80 ° C ili više, mogu biti važne u određenim vrstama hrane kao što su konzervirane..

Kvantifikacija mikroba se izražava u jedinicama koje formiraju kolonije (CFU) po gramu ili mililitru uzorka.

indeks

• 1 Temelj
• 2 Priprema
  • 2.1 Za tehniku ​​izlijevanja ploča
  • 2.2 Za površinsku sadnju
• 3 Upotrijebite
  • 3.1 Tehnika lijevanja ploče (zasijano dubinom)
  • 3.2 Tehnika zasijana na površini
• 4 Kontrola kvalitete
• 5 Ograničenja
• 6 Reference

temelj

Prosječna standardni račun je osmišljen kako bi se omogućilo zadovoljavajući razvoj nonfastidious aerobne bakterije kao što je ekstrakt kvasca, Trypticase i glukoze pružiti potrebne hranjive tvari za dobar rast mikroorganizama.

S druge strane, medij ima jasnu boju i prozirni izgled, zbog čega je idealan za prikazivanje kolonija razvijenih metodom duboke sjetve (sipanje u tanjur)..

Također je moguće brojati kolonije metodom sjetve na površini lopaticom Drigalskog.

Kada je mikrobiološko opterećenje veliko, potrebno je napraviti decimalna razrjeđenja uzorka koji se ispituje kako bi se brojali CFU-ovi.

Treba napomenuti da ovaj medij preporučuje Američka udruga za javno zdravstvo (APHA) za brojanje aerobnih mezofila.

priprema

Izvaže se 23,5 g dehidriranog medija i otopi u jednoj litri destilirane vode. Kako bi se potpuno otopila, mješavina se mora često zagrijavati dok ne prokuha. Pod-slijedeći koraci ovise o tehnici sjetve koja će se koristiti.

Za tehniku ​​izlijevanja ploča

Distribuirajte tako da u epruvete ispustite 12 do 15 ml. Zatim sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 15 minuta. Dopustite da se okomito učvrsti u obliku bloka. Čuvati u hladnjaku do uporabe.

Otopite znak kad će se koristiti. Kada se otopi, držati ga u vodenoj kupelji na 44-47 ° C dok se uzorci pripremaju.

Za sadnju na površini

Sterilizirajte medij u autoklavu na 121 ° C, a zatim rasporedite 20 ml u sterilne petrijeve zdjelice. Pustiti da se skrutne, preokrenuti i pohraniti u hladnjak do uporabe.

Oprati ploče prije uporabe. PH medija treba biti 7,0 ± 0,2.

upotreba

Brojanje agar standarda koristi se u tehnici brojanja aerobnih mezofila tijekom mikrobiološke analize vode i hrane. Potrebno je brojanje aerobnih mezofila, jer određuje sanitarnu kvalitetu ispitivanog uzorka.

Primjena ove tehnike (koristeći ovaj medij) omogućuje makroskopsku vizualizaciju izoliranih kolonija za njihovu kvantifikaciju.

Tehnika lijevanja plaka (zasijano dubinom)

-proces

Tehnika se sastoji od sljedećeg:

1) Homogenizirajte uzorak kako biste preraspodijelili prisutne bakterije.

2) Početna suspenzija se provodi u sterilnoj bočici ili vrećici, poštujući omjer 10 g ili 10 ml uzorka u 90 ml razrjeđivača (10^-1).

3) Od početne suspenzije odgovarajuća decimalna razrjeđenja se određuju ovisno o vrsti uzorka. Npr: (10^-2, 10^-3, 10^-4). Razrjeđenja su načinjena s peptonskom vodom ili fosfatnim puferom.

Da biste to učinili, uzmite 1 ml početne suspenzije i stavite u 9 ml razrjeđivača, ako je potrebno nastavite razrjeđivanje, uzimajući sada 1 ml razrjeđenja.^-2 i tako dalje.

4) Uzmite 1 ml svakog razrjeđenja i stavite u prazne sterilne Petrijeve posude.

5) Na svaku ploču dodajte 12 do 15 ml standardnog broja agara prethodno otopljenog i postavljenog na 44 - 47 ° C.

6) Omogućite glatke rotacijske pomake ploča da ravnomjerno rasporedite uzorak u agar i ostavite da se skrutne.

7) Obratite ploče i inkubirajte na 37 ° C u aerobiozi 24 do 48 sati.

8) Kada vrijeme završi, nastavite pregledati ploče i prebrojite kolonije u razrjeđenju koje to dopušta. Odabrana je za brojanje ploča koje imaju između 30 i 300 CFU.

Brojanje se može obaviti ručno ili se može koristiti oprema brojača kolonija.

Dopuštene vrijednosti po ml uzorka mogu varirati od jedne zemlje do druge prema standardima prema kojima se njima upravlja.

-Izračun UFC-a

Opći izračun izračunava se pomoću sljedeće formule:

Izrazite rezultate u 1 ili 2 znamenke, pomnožene s odgovarajućom bazom 10. Primjer: ako je rezultat 16.545, zaokružuje se na temelju treće znamenke na 17.000 i izražava se kako slijedi: 1.7 x 10⁴. Sada, ako je rezultat 16.436 zaokružen na 16.000 i izražen je 1.6 x 10⁴.

Tehnika je postavljena na površinu

-proces

-Inokulirajte s 0,1 ml izravnog uzorka ako je tekućina, početna suspenzija 10^-1 ili uzastopnih razrjeđenja 10^-2, 10^-3 itd., u sredini standardne ploče s agarskim računom.

-Uzorak ravnomjerno raspodijelite s Drigalskim lopaticom ili staklenom šipkom u obliku slova L. Ostavite stajati 10 minuta.

-Obratite se pločama i inkubirajte u aerobiozi na 37 ° C tijekom 24 do 48 sati.

-Nastavite brojati kolonije, odaberite one ploče koje su u rasponu od 20 - 250 CFU.

-Izračun UFC-a

Kako izračunati faktor razrjeđivanja, što je vrijedi obrnuto. je broj zaokruženi na dvije značajne znamenke (zaobljena prema trećem znamenku) se izražava u snage baze 10. Na primjer, ako 224 CFU strani u uzorku bez razrjeđenja (10^-1), Prijavljeno je 22 x 10¹  UFC, ali ako je brojka 225, prijavljuje se 23 x 10¹ UFC.

Sada, ako brojite 199 CFU u razrjeđenju 10^-3, Prijavit će se 20 x 10⁴ UFC, ali ako se broje 153 CFU u istom razrjeđenju, prijavit će se 15 x 10⁴ UFC.

Kontrola kvalitete

Standardni medij za kulturu brojanja može se procijeniti pomoću poznatih certificiranih sojeva, kao što su: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Ako je medij kulture u optimalnim uvjetima, očekuje se zadovoljavajući rast u svim slučajevima, osim L. fermentum koji mogu imati redovitu izvedbu.

Da bi se procijenila sterilnost medija kulture, jednu ili dvije ploče svake pripremljene šarže (neinokulirane) treba inkubirati na 37 ° C u aerobiozi tijekom 24 sata. Na kraju tog vremena ne treba promatrati rast ili promjenu boje medija..

ograničenja

-Nemojte rastopiti agar više od jednom.

-Pripremljeni medij može trajati do 3 mjeseca dok se čuva u hladnjaku i zaštićen od svjetlosti.

-Ovaj medij nije prikladan za zahtjevne mikroorganizme, niti za anaerob.

reference

1. Nacionalna uprava za lijekove Hrana i medicinska tehnologija (ANMAT). Mikrobiološka analiza hrane, službena analitička metodologija, indikatorski mikroorganizmi. 2014. Svezak 3. Dostupno na: anmat.gov.ar
2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Agar za brojanje ploča. 2009. Dostupno na: http://f-soria.es
3. Laboratoriji Conda Pronadisa. Agar za standardne metode (PCA) prema APHA i ISO 4833. Dostupno na: condalab.com
4. Laboratories Britania. Brojanje na agar ploči. 2015. Dostupno na: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B i Velázquez O. 2009. Tehnike za mikrobiološku analizu namirnica. 2nd ed. Kemijski fakultet, UNAM. Meksiko. Dostupno na: depa.fquim.unam