Agar M.R.S temelj, priprema i uporaba



agar M.R.S. je selektivni kruti medij kulture, korišten za izolaciju i brojanje bakterija mliječne kiseline, posebno roda Lactobacillus. Taj je agar 1960. godine stvorio čovjek, Rogosa i Sharpe, sredina istog imena, ali zbog svoje složenosti često se koristi skraćenica M.R.S..

Sastavljen je od proteoznog peptona, ekstrakta mesa, ekstrakta kvasca, glukoze, sorbitan monoleata, dikalijevog fosfata, natrijevog acetata, amonijevog citrata, magnezijevog sulfata, manganovog sulfata i agara..

Ovaj pripravak omogućuje pravilan razvoj bakterija mliječne kiseline iz kliničkih uzoraka, kao što su izmet, vaginalni sekret, oralni uzorci i majčino mlijeko, kao i mliječne i mesne hrane..

Ne koristi se rutinski u kliničkim laboratorijima, jer su bakterije mliječne kiseline rijetko uključene u patološke procese. Međutim, uporaba M.R.S agara je češća u području mikrobiologije hrane..

S druge strane, ovaj medij koriste neki istraživački centri čiji je cilj proučavanje bakterija mliječne kiseline.

indeks

  • 1 Temelj
  • 2 Priprema
  • 3 Upotreba
    • 3.1. Karakteristike kolonija
    • 3.2 Izolacija bakterija mliječne kiseline
    • 3.3 Brojanje bakterija mliječne kiseline
    • 3.4 Na razini istraživanja
  • 4 Kontrola kvalitete
  • 5 Reference

temelj

Agar Man, Rogosa i Sharpe ima vrlo složen sastav. Razbijanjem funkcije koju svaka od njegovih komponenti ispunjava, može se objasniti njezin temelj.

Proteozni pepton, ekstrakt mesa, ekstrakt kvasca i glukoza su hranjive tvari koje osiguravaju izvor ugljika, dušika, vitamina i minerala potrebnih za rast bakterija. Osim toga, glukoza je univerzalni izvor energije koji se koristi u većini medija za kulturu.

S druge strane, radi poticanja rasta bakterija mliječne kiseline, nužna je prisutnost neophodnih kofaktora (kationa) u metabolizmu Lactobacillusa i srodnih bakterija; Ovi spojevi su natrijeve, magnezijeve i manganove soli.

Isto tako, sorbitan monoleat ili polisorbat 80 su izvor važnih masnih kiselina kada se apsorbiraju kao hranjive tvari.

Osim toga, sorbitan monoleat i amonijev citrat djeluju inhibicijom razvoja prateće flore, osobito gram-negativnih bakterija, osiguravajući selektivni karakter ovog agara..

Konačno, agar-agar je ono što daje čvrstu konzistenciju mediju.

Postoje i druge varijante manga Man Rogosa Sharpe; jedan od njih je onaj nadopunjen cisteinom (M.R.S.c), vrlo koristan za izolaciju bifidobakterija, među ostalim mikroorganizmima. S druge strane, postoji MRS medij dopunjen neomicinom, paromomicinom, nalidiksičnom kiselinom i litijevim kloridom, posebno za selektivno brojanje bifidobakterija u mliječnim proizvodima..

priprema

Izvaže se 68,25 grama dehidriranog medija i otopi u jednoj litri destilirane vode. Ostavite stajati 5 minuta. Da bi se otopio u cijelosti, dovodite u izvor topline miješajući često i pustite da vrije 1 do 2 minute. Sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 15 minuta.

Kada ostavljate autoklav ostavite nekoliko minuta i rasporedite još vruće u sterilnim Petrijevim posudama.

Pustite da se skrutne i obrnuti ploče, naručite plakete i pohranite u hladnjak do uporabe. Pustite da ploče prije uporabe počnu uzimati sobnu temperaturu.

PH medija treba biti 6,4 ± 0,2. Neke komercijalne kuće preporučuju pH od 5,5 do 5,9.

Dehidrirani medij je bež i pripravljen je tamni jantar.

I dehidrirani medij i pripremljene ploče treba čuvati na 2 do 8 ° C.

aplikacije

Agar ploče M.R.S. mogu se sijati na površinu (iscrpljenost ili s lopaticom Drigalskog). Također se može sijati po dubini. Ploče treba inkubirati na 37 ° C u mikroaerofilnom obliku (4% O2 i 5-10% CO2) 24 do 72 sata.

Metoda zasijavanja se bira u skladu sa svrhom (izolacija ili brojanje).

Značajke kolonija

Vjerojatne kolonije Lactobacillusa rastu bjelkaste boje i imaju mukoidni ili kremasti izgled na ovom agaru. Tada se moraju identificirati.

Izolacija bakterija mliječne kiseline

U tu svrhu koristi se sadnja po površini. Uzorci koje treba posaditi zahtijevaju prethodni postupak. 

U slučaju uzoraka majčinog mlijeka, preporuča se centrifugirati 1 ml uzorka na 14.000 rmp tijekom 10 minuta, kako bi se uklonio masni sloj. 900 μl se odbaci, a u preostalih 100 μl sediment se suspendira i izlije na M.R.S. Tada se mora ravnomjerno raspodijeliti lopaticom Drigalskog.

U slučaju uzoraka stolice, jedan (1) gram fecesa se odmjeri i homogenizira u 9 ml 0,1% sterilne peptonirane vode, što odgovara razrjeđenju od 1/10. Zatim se naprave serijska razrjeđenja dok se ne dobije konačna razrjeđenja od 10-4.

Konačno, uzeto je 100 μl razrjeđenja 10-2, 10-3 i 10-4 i svako razrjeđenje je zasijano na MRS agaru, ravnomjerno raspodijeljeno s Drigalski spatulom.

Brojanje bakterija mliječne kiseline

U ovom slučaju sijanje se vrši dubinom.

Za uzorke majčinog mlijeka uzmite 1 mL i stavite u sterilnu konusnu plastičnu cijev. MRS agar je dodan na temperaturi od približno 40 ° C do konačnog volumena od 25 mL, čime je dobivena homogena smjesa. Zatim se ulije u sterilne petrijeve posude na ujednačen način i ostavi stajati dok se ne polimerizira..

Razrijeđenja su napravljena za uzorke stolice, kao što je gore opisano. Uzmite 1 mL svakog razrjeđenja i stavite u sterilne konusne plastične epruvete. Rastaljeni MRS agar je dodan u volumen od 25 mL.

Mješavina svakog razrjeđenja jednolično se ulije u sterilne Petrijeve posude. Napokon ostavite da stoji do polimerizacije.

Na razini istraživanja

Svakog dana proučavanje bakterija mliječne kiseline postaje zanimljivije; posebice znanstvenici žele upoznati nove vrste i njihov potencijal kao pokretanje fermenta za standardizaciju u proizvodnji mliječnih proizvoda, među ostalim.

U tom smislu, Alvarado et al. (2007) koriste agar M.R.S. provesti istraživanje u kojem su izolirali, identificirali i opisali bakterije mliječne kiseline prisutne u obučenom dimljenom venecuelanskom siru.

U siru su utvrdili prisustvo bakterija rodova Lactococcus i Lactobacillus, te zaključili da su smjese izoliranih sojeva prikladne kao početni sojevi u proizvodnji sireva iz pasteriziranog mlijeka..

S druge strane, Sánchez i sur. (2017) koriste agar M.R.S. istražiti prisutnost bakterija mliječne kiseline u probavnom traktu prasadi, kako bi ih koristili kao izvorne probiotike koji povećavaju produktivnost zdravih prasadi.

Ovim medijem uspjeli su izolirati četiri vrste: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae i Pediococcus pentosaceus.

Isto tako, Báez i sur. (2019) korišten je M.R.S. agar. procijeniti bakterije mliječne kiseline (BAL) i bifidobakterije s probiotičkim potencijalom u majčinom mlijeku i fekalijama dojenčadi.

Uspjeli su izolirati 11 BAL i 3 Bifidobacteria sp u majčinom mlijeku i 8 BAL i 2 Bifidobacteria sp. u stolici Svi su zadovoljili određene parametre koji ih akreditiraju kao bakterije s probiotičkom aktivnošću.

Autori su zaključili da i majčino mlijeko i izmet isključivo dojene djece služe kao prirodni izvori probiotičkih bakterija.

Kontrola kvalitete

Za procjenu kvalitete M.R.S. mogu se koristiti kontrolni sojevi kao što su:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli i Bacillus cereus.

Očekivani rezultati su zadovoljavajući rast za prvih 6 bakterija, dok E. coli i Bacillus cereus u cijelosti mora biti inhibiran.

reference

  1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolacija, identifikacija i karakterizacija bakterija mliječne kiseline iz Andskog ručno dimljenog venezuelskog sira. Koristi se kao početna kultivacija. Dovoljni. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Dostupno na: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabian F, Ochoa G, Alfaro izolacija bakterija mliječne kiseline iz probavnog trakta prasadi. Rev. veterinar. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Dostupno na: scielo.org.
  3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Procjena bakterija mliječne kiseline i bifidobakterija s probiotičkim potencijalom u majčinom mlijeku i izmetu djece u općini Acevedo, Miranda 2017. Dodiplomski rad za stjecanje diplome biološka testa. Sveučilište Carabobo, Venezuela.
  4. Britanski laboratorij M.R.S agar. 2015. Dostupno na: britanialab.com
  5. Doprinositelji Wikipedije. MRS agar Wikipedija, slobodna enciklopedija. 10. siječnja 2018. u 19:44 UTC. Dostupno na: wikipedia.org Pristupljeno 17. veljače 2019.
  6. Roy D. Mediji za izolaciju i brojanje bifidobakterija u mliječnim proizvodima. Int J Food Microbiol, 200.128; 69 (3): 167-82.