Agar Müeller Hinton temelj, priprema i uporaba



Müeller Hinton agar Riječ je o čvrstom, neselektivnom hranjivom mediju, koji se sastoji od infuzije mesa, peptina kazeinske kiseline, škroba, agara i destilirane vode. Ovaj medij omogućuje izvrstan mikrobiološki razvoj bakterija koje brzo rastu.

Izvorno su ga stvorili John Howard Müeller i Jane Hinton kako bi izolirali hranjivo zahtjevne bakterije, kao što su Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis. Međutim, pokazalo se da je zbog svojih karakteristika idealan za proučavanje osjetljivosti na antibiotike, dajući pouzdane i reproducibilne rezultate..

Zbog toga je agar Müeller Hinton medij kulture prihvaćen od strane Instituta za kliničke i laboratorijske standarde (CLSI) i Europskog odbora za ispitivanje antimikrobne osjetljivosti, za provođenje testa osjetljivosti na antimikrobne tvari metodom Kirby disk difuzije. Bauer.

indeks

  • 1 Temelj
  • 2 Priprema
  • 3 Upotreba
    • 3.1 Antimikrobna tehnika
    • 3.2 Strateško postavljanje diskova na agaru Müeller Hinton
  • 4 Uzroci pogrešnih rezultata
  • 5 Ograničenje
  • 6 Kontrola kvalitete
  • 7 Reference

temelj

Budući da se radi o neselektivnom hranjivom mediju, odličan je za rast većine patogenih bakterija.

S druge strane, njegova jednostavna kompozicija olakšava difuziju tvari na njoj, što je bitna karakteristika testa osjetljivosti metodom disk difuzije..

Još jedna od njegovih osobina je da sadrži malu količinu inhibitora, što omogućuje učinkovitu procjenu sulfonamida, trimetoprima i tetraciklina..

Međutim, mora se imati na umu da medij mora ispunjavati određene uvjete kako bi osigurao njegovo ispravno funkcioniranje, uključujući:

Podešavanje pH, dubina agara i odgovarajuća koncentracija timina, timidina, Ca++, mg++ i Zn++.

Također moramo znati da je metodologija standardizirana i stoga svi parametri moraju biti ispunjeni, kao što su:

Koncentracija inokuluma, koncentracija i očuvanje diskova antibiotika, postavljanje odgovarajućeg broja diskova na agar, udaljenost između jednog diska i drugog, strateško postavljanje određenih antibiotika, atmosfera, temperatura i vrijeme inkubacija.

priprema

Odviti 37 grama dehidriranog medija Müeller Hinton i otopiti u 1 litri destilirane vode. Zagrijte medij uz miješanje kako biste ga otopili. Pustite kuhati 1 minutu.

Autoklav se sterilizira na 121 ° C tijekom 15 minuta. Kada se uklanja iz autoklava, fiola treba staviti u vodenu kupelj na 50 ° C da se ohladi. Ulijte 25 do 30 ml u sterilne Petrijeve zdjelice promjera 10 cm.

Ploče bi trebale imati prosječnu debljinu od 4 mm (idealno), s dopuštenim rasponom od 3-5 mm.

Ako je poželjno pripremiti krvni agar koristeći Müeller Hinton bazu agara, 5% sterilne i defibrinirane janjeće krvi se ulije prije posluživanja na tanjure..

Konačni pH medija treba biti između 7,2 i 7,4.

Uložite i pohranite u hladnjak do uporabe. Pustite ploču prije upotrebe u sobnoj temperaturi.

Boja pripremljenog medija je svijetlo bež.

aplikacije

Koristi se za provođenje testa osjetljivosti na antibiogram ili antibiotike za većinu patogena koji ne rastu brzo.

Ako je agar dopunjen krvlju, služi za obavljanje antibiograma zahtjevnih mikroorganizama kao što su: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, među ostalima. Također je korišten za izolaciju Legionella pneumophila.

Tehnika antibiograma

Prije izvođenja antibiograma potrebno je pripremiti bakterijsku otopinu jednaku 1,5 x 108 ćelija.

Da bi se to postiglo, 3 do 4 kolonije su uzete iz čiste kulture i suspendirane u triptikaza sojinoj juhi ili u Müeller Hinton bujonu, inkubirane 2 do 6 sati i koncentracija je podešena sterilnom fiziološkom otopinom, uspoređujući je s Mac Farland standardom. 0.5%.

Ako su zahtjevni mikroorganizmi, kolonije se mogu suspendirati izravno sve dok ne dostignu koncentraciju od 0,5% Mac Farlanda. Nakon toga se ploča Müeller Hinton sije se brisom namočenim pripremljenom bakterijskom otopinom.

Da biste to učinili, umočite obrisak u otopinu i zatim uklonite višak tekućine pritiskom na zidove cijevi. Odmah nakon što je štapić prošao preko cijele površine, ne ostavljajući netaknuta mjesta, lagano zakrenite ploču i ponovno posijajte. Operacija se ponavlja još 2 puta.

Ostavite stajati 10 minuta i stavite diskove antibiotika sterilnim pincetom, ostavljajući između njih razmak od 24 mm. Nakon postavljanja svakog diska na agar, lagano pritisnite svaki s stezaljkom kako biste bili sigurni da su dobro zalijepljeni.

Nakon postupka, ploča se invertira i inkubira na 35-37 ° C u aerobiozi 16 do 18 sati. Ako je riječ o zahtjevnom mikroorganizmu, može zahtijevati mikroaerofiliju i ako antibiogram sadržava oksacilinske diskove, treba ga čitati 24 sata..

Za mjerenje promjera svakog haloa koristi se ravnalo. Rezultate treba zabilježiti u mm. Nakon toga, dobivene vrijednosti su u korelaciji s tablicama točaka rezanja koje je objavio trenutačni CLSI priručnik.

Navedite kao osjetljiv (S), intermedijer (I), ili otporan (R), ovisno o slučaju.

Antibiotici se odabiru prema izoliranom mikroorganizmu i vrsti infekcije koja se javlja.

Ponekad bi trebalo razmotriti strateško postavljanje antibiotika kako bi se pokazali fenotipski obrasci otpora.

Strateško postavljanje diskova na Müeller Hinton agar

Za enterobakterije, disk klavulanske kiseline mora se postaviti ispred cefalosporina treće i četvrte generacije. Proširenje u obliku jaja pokazuje da je soj proizvođač beta-laktamaza proširenog spektra (ESBL). To znači da se bolesnik ne smije liječiti bilo kojim cefalosporinom.

Kod stafilokoka važno je staviti disk eritromicina ili azitromicina ispred diska klindamicina (D-test).

Otporni halo u eritromicinu i ravnanje u halo klindamicina ukazuju da soj ima inducibilnu otpornost na klindamicin, soj (RIC). To znači da liječenje klindamicinom neće biti učinkovito.

Za traženje inducibilnih sojeva AMP C u enterobakterijama i nekim ne fermentirajućim gram negativnim bacilima, diskovi ceftazidima, cefoksitina ili piperacilin tazobaktana suočeni su s imipenemskim diskom, na udaljenosti od 27 mm..

Halo spljošten u jednom od diskova okrenutih imipenemu ukazuje na prisutnost inducibilnog AMP C.

Za traženje konstitutivnog AMP C, kloksacilin 500 μg diska je suočen s ceftazidimom (30 μg) i sa cefotaksimom (30 μg), na udaljenosti od 25 mm. Prošireni halo u jednom od cefalosporina ukazuje na pozitivnost.

Kloksacilinski disk se također može zamijeniti sa 9 mm diskom Whatman br. 6 filter papira impregniranim fenil boronskom kiselinom (400 μg) s udaljenosti od 18 mm. On se tumači kao i prethodni.

Konačno, istražiti proizvodnju metallo-beta-laktamaza, osobito u Pseudomonas aeruginosa, disk koji je impregniran s 10 μl etilendiamintetraoctene kiseline (EDTA 750 μg) i tioglikolne kiseline (SMA 300 μg), koji se suočava s diskovima imipenema i meropenema, koristi se na udaljenosti od 15 mm.

Test je pozitivan ako postoji širenje imipenema ili meropenema na disk EDTA / SMA. Ovaj rezultat mora biti potvrđen modificiranim Hodgeovim testom.

Ova metoda se sastoji u inokulaciji soja Escherichia coli ATCC 25922 na ploči Müeller Hinton. Imipenemski disk smješten je u središtu ploče, a zatim je napravljen žlijeb od diska prema periferiji s naprezanjem P. aeruginosa sumnjivo. Možete testirati do 4 soja po ploči.

Test će biti pozitivan ako postoji zona izobličenja imipenemskog haloa oko strije.

Uzroci pogrešnih rezultata

-Diskovi loše očuvanih antibiotika mogu proizvesti lažne otpore. Na primjer, oksacilinski disk je vrlo osjetljiv na temperaturne promjene.

-PH medija ispod navedenog (kiselina) proizvodi manje haloe u aminoglikozidima i makrolidima (rizik od lažne otpornosti), a veće haloe u penicilinu, tetraciklinu i novobiocinu (rizik od lažne osjetljivosti).

-Ako je pH iznad naznačenog (alkalnog), gore opisani učinci su obrnuti.

-Mediji s visokim koncentracijama timina i timidina značajno utječu na smanjenje inhibicijskih halogena sulfonamida i trimetoprima.

-Visoke koncentracije kalcija i magnezija uzrokuju lažnu rezistenciju aminoglikozida, polimiksina B i tetraciklina protiv sojeva Pseudomonas aeruginosa.

-Niske koncentracije kalcija i magnezija proizvode lažne osjetljivosti aminoglikozida, polimiksina B i tetraciklina protiv sojeva Pseudomonas aeruginosa.

-Prisutnost cinka utječe na rezultate diskova karbapenema (imipenem, meropenem i ertapenem).

-Debljina medija ispod 3 mm daje lažne rezultate osjetljivosti, dok će debljina iznad 5 proizvesti lažnu otpornost.

-Mobilizacija diskova u antibiogramu će dati deformirane oreole, jer je pražnjenje antibiotika odmah.

- Vrlo slabi inokulumi utječu na rezultate, budući da u agaru neće biti ravnomjernog ili konfluentnog rasta, što je nužan uvjet za mjerenje zona inhibicije, uz činjenicu da haloi mogu dati veći od normalnog..

-Preopterećeni inokul može dati haloes manji od normalnog.

-Nepoštivanje udaljenosti između diskova uzrokuje preklapanje jednog aureola i ne može se ispravno pročitati.

-Inkubirajte s CO2 povećava veličinu halos diskova tetraciklina i meticilina.

-Inkubacija na temperaturama ispod 35 ° C daje veće oreole.

-Dodatak krvi smanjuje veličinu halo sulfonamida.

ograničenje

Osjetljivost antibiotika prikazanog u antibiogramu protiv mikroorganizma (in vitro) nije jamstvo da će raditi in vivo.

Kontrola kvalitete

Da bi se znalo da li medij sadrži pravu količinu timina, potrebno je posijati soj Enterococcus faecalis ATCC 29212 i testirati osjetljivost na trimetoprim sulfametoksazol (SXT), treba dati halo jednak ili> 20 mm da bude zadovoljavajući.

reference

  1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedija, slobodna enciklopedija. Nov 16 2018, 12:23 UTC. 27. siječnja 2019., 04:22
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  3. Cona E. Uvjeti dobre studije osjetljivosti pomoću testa difuzije agara. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
  4. Laboratorij Difco Francisco Soria Melguizo. Müeller Hinton agar s 5% ovčje krvi. 2009. Dostupno na: http://f-soria.es
  5. Laboratorij za agar BD Müeller Hinton II. 2017. Dostupno na: .bd.com
  6. Laboratories Britania. Müeller Hinton agar. 2015. Dostupno na: britanialab.com
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. 5. izd. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  8. Martínez-Rojas D. Betalaktamas tipa AmpC: Općenito i metode za fenotipsko otkrivanje. Rev. Soc. Microhiol. 2009; 29 (2): 78-83. Dostupno na: scielo.org.
  9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotipska detekcija metalobetalaktamaza u kliničkim izolatima Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Dostupno na: scielo.org.