Temelj papa dekstroze, priprema i uporaba



papa dekstroza agar to je čvrsti, neselektivni hranjivi medij za kulturu. Može uzgajati bakterijske i gljivične vrste, ali je njegova uporaba posebno izražena za izolaciju nitastih gljivica i kvasaca. Također je poznat kao PDA medij engleskog izraza Potato Dextrose Agar.

Posebno je korisna za izolaciju fitopatogenih gljiva, odnosno onih koje pogađaju biljke. Da bi se uzgajali uzorci iz zaraženih biljaka, mogu se koristiti drugi mediji kao što je Sabouraud agar ili malta agar, međutim, za rutinsku upotrebu preferira se dekstroza agar krumpira zbog veće sporulacije..

Također se koristi za brojanje gljivičnih kolonija u uzorcima kozmetike, lijekova i nekih mliječnih proizvoda. Isto tako, pogodan je za uzgoj uzoraka kožnih ostataka u potrazi za dermatofitima, koji vrlo dobro rastu u ovom mediju, razvijajući njihove karakteristične pigmente..

Sredstvo za dekstrozu krumpira vrlo je jednostavno i lako se priprema u laboratoriju. Sadrži, kao što ime kaže, infuziju krumpira, dekstrozu i agar-agar. Dodatno se mogu dodati inhibitorne tvari kako bi se spriječio rast bakterija i povećala selektivnost za vrste gljivica.

indeks

  • 1 Temelj
  • 2 Priprema
    • 2.1 - Domaći (nekomercijalni) pripravak papa dekstroznog agara
    • 2.2 - Komercijalna priprema papa dekstroznog agara
  • 3 Upotreba
    • 3.1 Proces sadnje uzoraka biljaka na dekstroznom agaru krumpira
    • 3.2 Proces sadnje uzoraka kože, kose ili ljusaka za nokte na papi dekstroznom agaru
    • 3.3 Postupak identifikacije
    • 3.4 Broj kolonija
    • 3.5. Održavanje gljivičnih sojeva
  • 4 Kontrola kvalitete
  • 5 Reference

temelj

Papa dekstrozni agar je medij kulture koji osigurava potrebne nutritivne elemente za razvoj nitastih gljivica i kvasaca.

Kombinacija infuzije krumpira s glukozom pruža savršen izvor energije za zadovoljavajući rast gljivica. Dok je agar onaj koji osigurava konzistentnost okoline.

Sam medij ne inhibira rast bakterija, pa je to neselektivni medij. Da bi bila selektivna, potrebno je dodavanje inhibitornih tvari kao što je vinska kiselina ili antibiotici.

priprema

-Domaći (nekomercijalni) pripravak dekstroznog agara krumpira

Petrijeve posude

Priprema se na sljedeći način:

Prije svega, krumpir se dobro pere, uklanjajući prljavštinu koju imaju. Narezani su na tanke kriške sa svime i ljuskom. Odvaže se 200 g krumpira i stavi se da se kuha u litri destilirane vode pola sata.

Nakon isteka vremena filtrira se ili cijedi preparat kroz gazu.

Dobivena tekućina se dovrši destiliranom vodom dok ne dostigne jednu litru. U infuziju se doda 20 g agar-agara i 20 g dekstroze, dobro promiješa i autoklavira na 121 ° C, uz pritisak od 15 funti tijekom 15 minuta..

Ostaviti da se ohladi na 50 ° C i poslužiti u sterilnim Petrijevim posudama. Pripremljene ploče se čuvaju u hladnjaku.

podupirači

Također možete pripremiti papagajne dekstrozne agar-klinove.

U tom slučaju, prije sterilizacije u autoklavu, 12 do 15 ml medija se stavi u epruvete, zatim se autoklaviraju i nakon ostavljanja leže na posebnim nosačima dok se ne skrutne. Uštedite u hladnjaku.

Medij ostaje na pH 5,6 ± 0,2, međutim, neki laboratoriji dodaju 10% vinske kiseline kako bi snizili pH na 3,1 ± 0,1 kako bi spriječili rast bakterija..

U istom smislu, drugi laboratoriji radije dodaju antibiotike kako bi bili selektivni za uzgoj gljiva i spriječili razvoj bakterija..

-Komercijalna priprema dekstroznog agara krumpira

Izvaže se 39 g komercijalno dostupnog dehidriranog medija i otopi u jednoj litri destilirane vode. Ostavite u mirovanju 5 minuta.

Smjesa se zagrijava često miješanjem do potpunog otapanja. Zatim se sterilizira u autoklavu na 121 ° C tijekom 15 minuta.

Mogu se pripremiti ploče ili klinovi. Nastavite kako je gore opisano.

PH ostaje na 5.6 ± 0.2. Ako se želi postići pH od 3,1, 14 ml 20% sterilne vinske kiseline treba dodati prije posluživanja na ploče..

Boja nepripremljenog medija je bež i pripremljena je svijetlo jantarasta s blago mutnim ili opalescentnim izgledom.

aplikacije

Postupak sadnje uzoraka biljaka u dekstroznom agaru krumpira

-Za lišće s mrljama

Listovi su izrezani na komade.

U staklu od 50 cm s 50% alkohola, stavite komade lišća (komadiće umrljani i zdravi) kako biste površinu dezinficirali 20 do 30 sekundi. Povucite alkohol i dodajte 20% natrijevog hipoklorita 40 do 50 sekundi ako su tanki i povećajte vrijeme na 80 sekundi ako je kora i trupci.

Povucite natrijev hipoklorit i sterilnom isječkom uzmite dezinficirane komade i stavite ih na površinu medija (najviše 10 komada). Stavite datum i inkubirajte od 20 do 30 ° C.

-Za voće i gomolje

Ako je plod mesnat, otvorite plod koji je zahvaćen gljivicama i uzmite komadiće sa sterilnim skalpelom, i oboljelim dijelom i zdravim dijelom i stavite ga na površinu agara..

Ako je voće citrusa, kao što je limun ili naranča, trebali biste otvoriti i posijati sjeme.

Kada je površina ploda zahvaćena i spore se promatraju, najbolje je koristiti narezanu metodu na tanjuru; ovo se sastoji od dodirivanja spora lopaticom u obliku "L" steriliziranog i ohlađenog, a zatim izvođenje cik-cak sijanje 2 do 3 puta na agaru.

-Za žitarice

Oni se dezinficiraju kako je opisano u listovima i zatim se stavljaju na agar.

-Za grane i stabljike

Provodi se struganje kore, a zatim se komadi zdravog i bolesnog dijela uzmu i posiju izravno na agar..

Posijane ploče se inkubiraju u aerobiozi pri 20-30 ° C tijekom 72 sata.

Proces sadnje uzoraka kože, kose ili ljusaka za nokte na papi dekstroznom agaru

Uzorak se mora uzimati pomoću oštrice skalpela br. 11, bilo za rezanje pogođene kose, kožnih pahuljica ili noktiju u potrazi za dermatofitima. Prije uzimanja uzorka, područje treba dezinficirati 70% -tnim alkoholom.

-Uzorak kože

Kod ljuskastih lezija rub lezije treba strugati, jer postoji veća vjerojatnost da se pronađe gljivica.

U eksudativnim lezijama uzorak se uzima suhim ili mokrim obriskom. Sijte odmah na dekstrozni agar krumpira ili Sabouraud agar. Izbjegavajte prijevozna sredstva.

Druga metoda uzorkovanja je kvadratna tehnika tepiha Mariata i Adana Camposa. U tom slučaju zahvaćeno područje se utrljava 5 puta s komadom sterilne vune za daljnju kultivaciju.

Uzorak se može staviti izravno u medij za kulturu.

-Uzorak kose

Ovisno o patologiji, zahvaćeni dio može biti odrezan ili oderan od korijena. Stavite uzorak u medij za kulturu.

-Uzorak noktiju

Možete ostrugati ili izrezati određeni dio zahvaćenog nokta. To će ovisiti o vrsti ozljede.

Prerezati uzorak na komade od 1 mm prije sjetve kako bi se povećala vjerojatnost dodira gljivice s medijem za kulturu..

Postupak identifikacije

Kolonije dobivene na ploči se izoliraju u epruvete koje sadrže agar dekstroze krompira radi provođenja makroskopskog ispitivanja kolonija (izgled, boja, konzistencija, stupanj razvoja)..

Mikroskopsko istraživanje (promatranje struktura i njihovih formacija) može se provesti mikrokulturom ili izravnim promatranjem pod mikroskopom između lamele i lamele.

Broj kolonija

Ovaj medij se također može koristiti za određivanje opterećenja gljivicama i kvascima prisutnim u uzorcima biljaka, hrani, kozmetici ili lijekovima. U tu svrhu koristi se papa dekstroza agar s dodatkom antibiotika, kao što su: (kloramfenikol, klorotetraciklin ili oboje).

Ulijte 1 ml uzorka - po mogućnosti razrijeđenog - u sterilnu i praznu Petrijevu zdjelicu, zatim otopite čep od dekstroze agar krumpira i pustite da se ohladi na 45 ° C. Prelijte preko petrijeve zdjelice i rotirajte dok se ne homogenizira. Ostavite ga da miruje dok se ne učvrsti.

Inkubirajte u aerobiozi na 20-25 ° C (plijesni) ili na 30-32 ° C (kvasac) 5 do 7 dana ili više, ovisno o vrsti gljive koju tražite i vrsti uzorka. Dvije ploče se mogu koristiti za inkubaciju u oba temperaturna područja.

Održavanje gljivičnih sojeva

Papa dekstrozni agar može se koristiti za održavanje održivih gljivičnih sojeva nekoliko godina.

Da bi se to postiglo, gljiva se uzgaja na papagama dekstroznih agara i jednom kada se gljiva uzgaja, prekrije se mineralnim uljem. Ulje mora biti sterilizirano u autoklavu tijekom 45 minuta i mora imati približnu viskoznost od 300 do 330 Saybolta. Ulje bi trebalo biti veće od koničnog zuba za 1 do 2 cm.

Kontrola kvalitete

Iz svake pripremljene šarže treba uzeti jednu ili dvije ploče i inkubirati na 25 ° C 48 sati ili na 20 ° C 96 sati. Dobra kontrola sterilnosti je ona u kojoj nema razvoja kolonija.

Također poznati ili certificirani kontrolni sojevi kao što su:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. U svim slučajevima očekuje se dobar rast.

reference

  1. Laboratories Britania. Papa glucosado agar. 2015. Dostupno na: britanialab.com
  2. Neogen Laboratories Krompirni dekstroza agar. Dostupno na: foodsafety.neogen.com
  3. Laboratorij za insumolab Krumpirski dekstrozni agar. Dostupno na: insumolab.cl
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Uvodnik Panamericana S.A. Argentina.
  5. Casas-Rincon G. Opća mikologija. 1994. 2. izdanje Universidad Central de Venezuela, Knjižnična izdanja. Venecuela, Caracas.
  6. Aceituno M. Procjena mikrobiološke kakvoće u sjenilu za oči, kompaktni tip praha nacionalnog proizvodnog laboratorija, prema referentnoj metodi farmakopeje iz 2005. godine. Sveučilište San Carlos de Guatemala.
  7. Cuétara M. Obrada površinskih uzoraka. Iberoamerican Mycology Magazine. 2007; str. 1-12