Agar Sabouraud temelj, priprema i uporaba

Sabouraud agar, Također poznat kao Sabouraud dekstrozni agar, to je kruti medij kulture, posebno obogaćen za izolaciju i razvoj gljivica, kao što su kvasci, plijesni i dermatofiti..

Prema tome, ovo sredstvo ne može nedostajati u mikrobiološkom laboratoriju za ispitivanje prisutnosti patogenih ili oportunističkih gljiva, bilo iz kliničkih ili nekliničkih uzoraka. Isto tako, ona je također idealna za rast nitastih bakterija kao što su Streptomyces i Nocardia. Njegova upotreba je vrlo široka, može se koristiti u ljudskoj, životinjskoj, biljnoj i industrijskoj mikologiji.

Ovaj medij nastao je 1896. godine od strane renomiranog dermatologa Raimonda Sabourauda, ​​koji je postao svjetski poznati stručnjak za poremećaje vlasišta, uglavnom uzrokovanih dermatofitima..

Njegovo stvaranje bilo je toliko važno da se od tada koristi i nastavlja se i danas, iako s nekim izmjenama.

Iako je to posebno za gljivice, u ovom mediju bakterije mogu rasti, stoga za uzorke sa miješanom florom potrebno je uključiti antibiotike u njihovu pripremu i tako spriječiti rast bakterijske flore koja može biti prisutna..

Izbor antibiotika treba biti pažljiv i uzimajući u obzir vrstu gljive koju želite oporaviti, jer su neke inhibirane u prisutnosti određenih tvari.

indeks

• 1 Temelj
  • Najčešće su korištene kombinacije Sabouraud dekstroznog agara s antibioticima
• 2 Priprema
  • 2.1 Dekstroza Sabouraud Agar 
  • 2.2 Sabouraud dekstroza agar (modifikacija emonsa)
  • 2.3 Sabouraud dekstrozni agar (modifikacija Emmonsa) s kloramfenikolom
  • 2.4 Dekstroza Sabouraud Emmons agar s cikloheksimidom
  • 2,5 agar dekstroze Sabouraud (Emmons) s kloramfenikolom i cikloheksimidom
  • 2.6 Ostali antibiotici koji se mogu dodati
• 3 Posebna razmatranja
• 4 Kontrola kvalitete
• 5 Upotreba
  • 5.1 Primarna kultivacija
  • 5.2 Sporulacija
  • 5.3 Očuvanje
  • 5.4 Mikrokulture
  • 5.5 U ljudskoj mikologiji
  • 5.6. Životinjska mikologija
  • 5.7 Mikologija okoliša
  • 5.8 Industrijska mikologija
  • 5.9 Mikološka biljka
• 6 Reference

temelj

Sabouraud dekstrozni agar je medij koji je u svojoj izvornoj formulaciji slabo selektivan, zbog kiselog pH od 5,6 ± 0,2, međutim bakterija se još uvijek može razviti, uglavnom u dugotrajnim inkubacijama..

Medij sadrži kazein pepton i probavljeno tkivo pankreasa, koje osiguravaju izvor ugljika i dušika za razvoj mikroorganizama..

Također sadrži visoku koncentraciju glukoze, koja djeluje kao izvor energije, favorizirajući rast gljivica nad bakterijama. Sve je pomiješano s agar-agar, komponentom koja osigurava ispravnu konzistenciju.

S druge strane, Sabouraud dekstrozni agar može biti selektivan ako se dodaju antibiotici.

Kod antibiotika je posebno korisno u uzorcima rana, otvorenim čirevima ili bilo kojem uzorku u kojem se sumnja na veliku bakterijsku kontaminaciju.

Većina se koristila kombinacijama Sabouraud dekstroznog agara s antibioticima

-Sabouraud agar s kloramfenikolom: idealan za oporavak kvasaca i filamentoznih gljiva.

-Sabouraud agar s gentamicinom i kloramfenikolom: u ovom mediju rastu gotovo sve filamentozne gljivice i kvasac, te inhibiraju veliki broj bakterija, uključujući enterobakterije, pseudomonaze ​​i stafilokoke..

-Sabouraud agar s cikloheksimidom: posebno je koristan za uzorke iz kože ili respiratornog trakta, sve dok postoji sumnja na dimorfne gljive.

Cikloheksimid treba koristiti s oprezom; Iako se koristi za inhibiciju rasta nepatogenih ili ekoloških gljiva i kvasaca koji mogu biti prisutni kao kontaminanti u uzorku, on također inhibira rast nekih gljiva kao što je Cryptococcus neoformans,  Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp i druge oportunističke gljive.

-Sabouraud agar s kloramfenikolom i cikloheksimidom: koristi se uglavnom za izoliranje dimorfnih dermatofita i gljivica. Nedostatak je da inhibira neke vrste oportunističkih gljiva kao Candida ne albicans, Aspergillus, Zygomycetes ili C. neoformans.

-Sabouraud agar s kloramfenikolom, streptomicinom, penicilinom G i cikloheksimidom: idealan je za uzorke koji su izuzetno kontaminirani bakterijama i saprofitičnim gljivama, ali ima nedostatak da inhibira rast Actinomyces i Nocardias, uz oportunističke gljive spomenute gore.

priprema

Ako imate sastojke odvojeno, možete ih pripremiti na sljedeći način:

Dekstrozni agar Sabouraud 

žaljenje:

- 40 gr dekstroze

- 10 g peptona

- 15 gr agar-agara

- Izmjerite 1000 ml destilirane vode

Svi sastojci su pomiješani, pH je podešen na 5.6. Otopiti otopljene tvari vrelištem, rasporediti 20 ml medija u epruvete 25 x 150 mm, bez prirubnice i s pamučnim vrhom po mogućnosti.

Mogu se koristiti i druge veličine cijevi, ovisno o raspoloživosti.

Autoklaviraju se 10 minuta u atmosferi pod tlakom (121 ° C). Nemojte prekoračiti vrijeme autoklaviranja. Kada napuste autoklav, cijevi se naginju uz potporu sve dok se ne stvrdnu u vrhu flaute..

Drugi način je otopiti sastojke zagrijavanjem dok ne prokuha. U istom autoklavu fiola 10 minuta i zatim rasporediti 20 ml u Petrijeve posude.

Ako je dostupan Sabouraud medij za dekstrozni agar, koji već sadrži sve sastojke, nastavljamo vagati količinu koju je odredila komercijalna kuća za jednu litru vode. Ostali koraci su isti kao oni opisani gore.

Dekstroza agar Sabouraud (modifikacija Emmonsa)

žaljenje:

-  20 gr dekstroze

- 10 g peptona

-  17 gr agar-agara

-  Izmjerite 1000 ml destilirane vode

Svi sastojci su pomiješani, pH je podešen na 6,9. Nastavite na isti način kao u prethodnom slučaju.

Postoje komercijalne kuće koje nude medije sa svim sastojcima. U tom slučaju izvagajte i pripremite kako je opisano u umetku.

Sabouraud dekstrozni agar (modifikacija Emmonsa) s kloramfenikolom

Osnovna otopina kloramfenikola

- Izvagati 500 mg baze kloramfenikola

- Izmjerite 100 ml 95% etanola

- miješati

Sabouraud medij za dekstrozni agar (Emmons) je pripravljen kao što je gore opisano i, dodatno, za svaku litru medija, prije autoklaviranja dodajte 10 ml otopine kloramfenikola..

Dekstrozni agar Sabouraud Emmons s cikloheksimidom

Osnovna otopina cikloheksimida

- Izvagati 5 grama cikloheksimida

- Izmjerite 100 ml acetona

- miješati

Sabouraud medij za dekstrozni agar (Emmons) priprema se kako je već opisano i dodatno za svaku litru medija doda se 10 ml temeljne otopine cikloheksimida prije autoklaviranja.

Sabouraud dekstrozni agar (Emmons) s kloramfenikolom i cikloheksimidom

Sabouraud medij za dekstrozni agar (Emmons) se priprema kako je gore opisano i dodatno za svaku litru medija doda se 10 ml otopine kloramfenikola i 10 ml zaliha cikloheksimida prije autoklaviranja.

Ostali antibiotici koji se mogu dodati

20.000 do 60.000 jedinica penicilina po litri medija.

30 mg streptomicina po litri medija.

Obje bi se trebale ugraditi nakon autoklaviranja medija, lagano ohlađenog (50-55 ° C).

0,04 g neomicina po litri medija.

0,04 g gentamicina po litri medija.

Posebna razmatranja

Radi sigurnosti, poželjno je da se Sabouraud dekstrozni agar posadi u klinastim epruvetama (nagnutim u vrh flaute), a ne u Petrijevim posudama, kako bi se izbjegla disperzija i inhalacija spora..

Važno je da cijevi sa Sabouraud agarom budu pokrivene pamukom, a ne vijčanom kapom, jer je pokazano da semianaerobni uvjeti inhibiraju stvaranje spora u nekim sojevima, na primjer Coccidioides immitis. Osim toga, većina gljivica je aerobna.

Ako koristite navojnu kapu, nemojte je zatvoriti.

Kontrola kvalitete

Pripremljeni medij mora imati kontrolu kvalitete kako bi se provjerilo njihovo ispravno funkcioniranje. U tu svrhu, sije se određeni kontrolni sojevi.

Za Sabouraud dekstrozni agar s kloramfenikolom mogu se koristiti ATCC sojevi. Candida albicans, koji mora imati odličan rast. Druga ploča inokulirana je sojevima Escherichia coli, mora biti potpuno spriječen.

Neinokulirana ploča se inkubira u kojoj mikroorganizam ne smije rasti.

Sabouraud dekstroza agar s kloramfenikolom i cikloheksimidom mogu se koristiti sojevi  Trichophyton mentagrophytes, moraju se dobro razvijati. Druga ploča se inokulira sa sojem Aspergillus flavus, u kojima mora postojati mali rast ili rast. Dodatno, neinokulirana ploča se inkubira kako bi se pokazala njegova sterilnost.

Za Sabouraud dekstrozni agar s cikloheksimidom, sojevi Candida albicans, Trichophyton rubrum  ili Microsporum canis, koji bi trebali pokazati dobar rast.

Isto tako, naprezanje Aspergillus flavus, koji pokazuju slab rast ili nikakav rast. Konačno inkubirajte neinokuliranu ploču za kontrolu sterilnosti.

aplikacije

Primarna kultivacija

Klasični Sabouraud dekstrozni agar sadrži 4 grama dekstroze i odličan je kao primarni medij za izolaciju, budući da pokazuje karakterističnu morfologiju svake gljivice..

Također je odličan za demonstraciju proizvodnje pigmenata. Međutim, to nije najprikladnije sredstvo za promatranje sporulacije.

Također nije preporučljivo rasti Blastomyces dermatitidis, koji je inhibiran visokom koncentracijom prisutne glukoze.

S druge strane, za kultiviranje se moraju imati na umu određena razmatranja.

Neke se gljivice bolje razvijaju na sobnoj temperaturi, kao što su plijesni, druge se uspješno razvijaju na 37 ° C, poput nekih kvasaca, a druge se mogu razviti na obje temperature (dimorfne gljive).

Iz tog razloga, ponekad je potrebno koristiti nekoliko Sabouraud agar ploča za isti uzorak, jer su često posađene u duplikatu da inkubiraju jednu ploču na sobnoj temperaturi i drugu ploču na 37 ° C..

Na primjer, Sporothrix schenckii sije se u dvije ploče; jedan se inkubira na sobnoj temperaturi kako bi se dobila faza plijesni, a druga se inkubira na 37 ° C kako bi se dobila faza slična kvascu, ali u potonjem je potrebno dodati 5% krvi u medij.

U drugim slučajevima, kao u uzorcima mycetomas, sije se dvije ploče Sabouraud agara, jedna s kloramfenikolom, a druga s cikloheksimidom. Prvi će omogućiti rast uzročnika miketoma gljivičnog podrijetla (Eumicetoma) i drugog uzročnika miketeta bakterijskog podrijetla, kao što su aktinomicetom..

sporulacijom

Dekstroza Sabouraud agar modificiran Emmonsom sadrži 2 grama dekstroze i ne koristi se samo za izolaciju, već i za sporulaciju i konzervaciju gljiva..

U ovom mediju ako možete oporaviti sojeve Blastomyces dermatitidis.

konzervacija

Za očuvanje gljivičnih kultura mogu se čuvati u hladnjaku (2-8 ° C). Vrijeme skladištenja može varirati od 2 do 8 tjedana. Nakon tog vremena moraju se podkultivirati kako bi se postupak ponovio.

Neke se gljive najbolje održavaju na sobnoj temperaturi, kao što je Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum i Microsporum audounii.

Održavanje soja može se produžiti kako bi se izbjegao pleomorfizam ako se dekstroza potpuno ukloni iz agara i ako se količina agara u mediju smanji kako bi se izbjegla suhoća..

mikrokulture

Za identifikaciju nekih filamentoznih gljiva potrebno je provesti mikrokulture pomoću Sabouraud agara ili drugih posebnih sredstava za promatranje struktura spolne i aseksualne reprodukcije.

U ljudskoj mikologiji

Koristi se uglavnom za dijagnosticiranje gljivičnih oboljenja, osobito onih koje utječu na kožu i njezine vezanosti (kosa i nokti).

Uzorci mogu biti izlučevine, eksudati, koža, kosa, nokti, sputum, CSF ili urin. Uobičajeno izolirani patogeni su dermatofiti, gljivice koje uzrokuju subkutane i sistemske gljivične infekcije.

Životinjska mikologija

Životinje su često pogođene gljivičnim infekcijama, tako da je Sabouraud agar jednako koristan u životinja kao iu ljudskoj mikologiji..

Na primjer, dermatofiti često mogu utjecati na životinje. Takav je slučaj Microsporum canis var, koji često inficiraju pse, mačke, konje, svinje i majmune. također, Microsporum gypseum zarazi pse, mačke i goveda.

Ptice kao što su kokoši, pijetlovi i kokoši su pod utjecajem Microsporum gallinae.

Ostale gljive, kao Zymonema farciminosum, oni su također uzrok bolesti kod životinja, uglavnom kod konja, mula i magaraca, što uzrokuje značajnu upalu limfnih žila.

Sporothrix schenkii i Histoplasma capsulatum utječu na domaće i ljudske životinje.

Mikologija okoliša

Mnoge patogene ili oportunističke gljive mogu se koncentrirati u bilo kojem trenutku u određenom okruženju, posebno u operacijskim dvoranama i jedinicama intenzivne njege (ICU) klinika i bolnica. Stoga ih je potrebno kontrolirati.

Ostali ranjivi prostori su knjižnice i stare zgrade, na koje može utjecati koncentracija ekoloških gljiva.

U studijama o okolišu Sabouraud dekstrozni agar koristi se za izolaciju gljivica.

Industrijska mikologija

Sabouraud dekstrozni agar ne može nedostajati za proučavanje zagađivača gljivica u proizvodnji kozmetike, hrane, pića, kože, tekstila, između ostalog.

Mikološka biljka

Biljke također pate od bolesti uzrokovanih gljivama, koje pogađaju različite dijelove biljke, što čak može zaustaviti žetvu, uzrokujući velike gubitke u poljoprivredi..

reference

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiološka dijagnostika mikoza i studije osjetljivosti na antifungale. Preporuke Španjolskog društva za infektivne bolesti i kliničku mikrobiologiju. Dostupno na: coesant-seimc.org
2. Laboratorij ValteK. (2009). Sabouraud dekstrozni agar s cikloheksimidom. Dostupno na: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Veterinarska mikologija. Nacionalno agrarno sveučilište. Nikaragva.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Uvodnik
5. Casas-Rincon G. Opća mikologija. 1994. 2. izdanje Universidad Central de Venezuela, Knjižnična izdanja. Venecuela, Caracas.