Temelj krvi, uporaba i priprema

krvni agar on je obogaćeni čvrsti medij, diferencijalni, ali ne i selektivan. Koristi se za oporavak i rast velikog broja mikroorganizama iz kliničkih uzoraka ili subkultura.

Klasični krvni agar treba uključiti za zasađivanje većine kliničkih uzoraka primljenih u laboratorij; osim uzoraka stolice gdje nije koristan, ako nije pripremljen s određenim modifikacijama.

Ovaj medij kulture u osnovi se sastoji od obogaćenog baznog agara i 5% krvi. Baza agara može varirati ovisno o potrebama, ali će se uglavnom sastojati od peptona, aminokiselina, vitamina, ekstrakta mesa, natrijevog klorida, agara,.

Što se tiče krvi, obično je potrebno imati kontakt s bioterijem kako bi se dobila krv od životinja, kao što su ovce, zec ili konj. Međutim, to nije uvijek moguće, a ponekad se koristi i ljudska krv.

Medij za krvni agar može se pripremiti u laboratoriju ili se može kupiti spreman za tvrtke koje su mu posvećene. Priprema ovog medija je jedna od najdelikatnijih, svaka nepažnja u njezinoj pripremi rezultirat će kontaminiranom šaržom.

Zbog toga treba poduzeti sve moguće mjere opreza i na kraju provoditi kontrolu kvalitete na 37 ° C 1 ploču na svakih 100 pripravaka..

indeks

• 1 Temelj
• 2 Upotreba
  • 2.1. Odabir krvne grupe
  • 2.2 Izbor vrste baznog agara
  • 2.3. Upotreba krvnog agara prema osnovnom mediju za njegovu pripremu
• 3 Priprema
  • 3.1 Izvagati i otopiti
  • 3.2 Sterilizirajte
  • 3.3 Agregacija krvi
  • 3.4. Ulijte u Petrijeve posude
• 4 Reference

temelj

Već je spomenuto da krvni agar ima svojstvo obogaćenog, diferencijalnog i neselektivnog medija. Podloga svakog od ovih svojstava objašnjena je u nastavku.

Krvni agar je obogaćeni medij jer ima kao glavni aditiv 5-10% krvi na bazi agara. Oba spoja sadrže mnogo hranjivih tvari i to svojstvo omogućuje da većina kultiviranih bakterija raste u njemu.

Taj rast se odvija bez ograničenja; zbog toga je neselektivan. Međutim, ako se u ovaj medij dodaju spojevi koji sprječavaju rast nekih mikroorganizama i pogoduju rastu drugih, on postaje selektivan. To je slučaj ako se dodaju određene vrste antibiotika ili antifungali.

Isto tako, krvni agar je diferencijalni medij, jer omogućuje razlikovanje 3 vrste bakterija: beta-hemolitičku, alfa-hemolitičku i gama-hemolitičku..

Beta-hemolitike su one koje imaju sposobnost liziranja ili potpunog razbijanja crvenih krvnih zrnaca, formirajući jasan halo oko kolonija, stvarajući tako ß ili β hemolizu - hemoliza i mikroorganizmi se nazivaju ß-hemolitikom.

Primjeri ß-hemolitičkih bakterija su Streptococcus pyogenes i Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolitike su one koje izvode djelomičnu hemolizu, gdje se hemoglobin oksidira u methemoglobin, stvarajući zelenkasto obojenje oko kolonija. Ovaj fenomen poznat je kao hemoliza α ili α-hemoliza, a bakterije su klasificirane kao α-hemolitik.

Primjer α-hemolitičkih bakterija jesu Streptococcus pneumoniae i Streptococcus grupe viridanskom.

Konačno, tu su i bakterije koje se nazivaju gama-hemolitički ili ne-hemolitički. Oni rastu na agaru bez stvaranja promjena na njemu, učinak poznat kao γ-hemoliza, a mikroorganizmi su γ-hemolitički.

Primjer γ-hemolitičkih bakterija: neki sojevi Streptococcus grupe D (Streptococcus bovis i Enterococcus faecalis).

aplikacije

Medij za kulturu krvnog agara jedan je od najčešće korištenih u mikrobiološkom laboratoriju.

Među mikroorganizmima koji mogu rasti na mediju krvnog agara su: stroge, fakultativne, mikroaerofilne, anaerobne, gram-pozitivne ili gram-negativne aerobne bakterije, brzo rastuće ili sporo rastuće bakterije..

Neke bakterije koje su zahtjevne ili uznemirujuće s prehrambene točke gledišta, kao i gljivice i kvasci, također rastu. Isto tako, korisno je subkultivirati ili reaktivirati sojeve koji su metabolički vrlo slabi.

Međutim, izbor krvne grupe i baznog agara će varirati ovisno o vjerojatnom mikroorganizmu za koji se sumnja da je oporavak i upotrebi plaka (kultura ili antibiogram)..

Izbor krvne grupe

Krv može biti janjetina, zec, konj ili čovjek.

Najviše se preporučuje janjeća krv, uz neke iznimke. Na primjer, izolirati vrste Haemophilus, gdje je preporučena krv konj ili zec, budući da janjetina krv ima enzime koji inhibiraju faktor V.

Najmanje se preporuča čovjek, no on je najčešće korišten, možda zato što ga je najlakše dobiti. 

Krv mora biti defibrinirana, dobivena bez aditiva i od zdravih životinja. Za primjenu ljudske krvi treba imati na umu nekoliko čimbenika:

Ako krv dolazi od osoba koje su pretrpjele bakterijske infekcije, imat će specifična antitijela. Pod tim uvjetima vjerojatno će biti inhibiran rast nekih bakterija.

Ako se dobije iz banke krvi, sadrži citrat i moguće je da se određene bakterije ne razvijaju u njegovoj prisutnosti. S druge strane, ako krv dolazi od pacijenata koji uzimaju antibiotike, rast osjetljivih bakterija može biti inhibiran.

A ako je krv od dijabetičara, višak glukoze ometa pravilan razvoj uzoraka hemolize.

Izbor tipa baznog agara

Osnovni agar koji se koristi za pripravu krvnog agara može biti vrlo širok. Među njima su: hranjivi agar, agar za infuziju mozga, triptikaza sojin agar, Müeller Hinton agar, Thayer Martin agar, Columbia agar, Brucella agar, Campylobacter agar itd..

Upotreba krvnog agara prema osnovnom mediju korištenom za njegovu pripremu

Hranjivi agar

Ova baza je najmanje korištena, jer će na njoj rasti uglavnom nezahtjevne bakterije, kao što su crijevne bacile, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, među ostalima. Ne preporuča se izolirati Streptococcus.

Agar za infuziju srčanog mozga (BHI)

Jedna je od najčešće korištenih kao osnova krvnog agara, jer ima potrebne hranjive tvari za rast većine bakterija, uključujući Streptococcus sp i druge zahtjevne bakterije. Iako nije prikladno promatrati obrasce hemolize.

S ovom bazom obično se koristi janjeća krv.

Također se mogu pripremiti varijante krvnog agara, gdje se drugi spojevi dodaju da izoliraju određene mikroorganizme. Na primjer, agar za infuziju mozga srca dopunjen krvlju zeca, cistinom i glukozom služi za izolaciju Francisella tularensis.

Dok, s cistinom telurit je koristan za izolaciju Corynebacterium diphteriae. Možete koristiti ljudsku ili janjeću krv.

Prvo će beta-hemoliza izgledati kao uski halo, dok će s drugim biti mnogo širi.

Isto tako, ova baza zajedno s bacitracinom, kukuruznim škrobom, konjskom krvi i drugim dodatcima za obogaćivanje (IsoVitaleX) koristi se za izolaciju roda Haemophilus sp iz dišnih uzoraka.

Također, ako dodate kombinaciju antibiotika kloramfenikol - gentamicin ili penicilin - streptomicin s konjskom krvlju, idealan je za izolaciju zahtjevnih patogenih gljivica, čak i uz veći prinos od Sabouraudova glukoznog agara. To je osobito korisno u izolaciji Histoplasma capsulatum.

Probna soja

Ova baza se najviše preporučuje za bolje promatranje uzorka hemolize i obavljanje dijagnostičkih testova kao što su svojti optokvina i bacitracina. To je klasični krvni agar koji se koristi rutinski.

S ovom bazom možete pripremiti i specijalni krvni agar Corynebacterium diphteriae, s telurnim cistinom i janjetina krv.

Isto tako, kombinacija ovog agara s janjećom krvi i kanamicinom-vankomicinom idealna je za rast anaerobnih stanica, posebno Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton

Ova baza nadopunjena krvlju koristi se za izvođenje antibiograma zahtjevnih mikroorganizama, kao što je Streptococcus sp.

Također je koristan za izolaciju bakterija kao što je Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Ovaj medij je idealan kao baza za krvni agar kada se sumnja na rod Neisseria, osobito Neisseria meningitidis, kao N. gonorrhoeae ne raste na krvnom agaru.

Također služi i za ispitivanje osjetljivosti Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Ova baza je izvrsna za sijanje uzoraka želučanih biopsija u potrazi za Helicobacter pylori.

Medij se priprema dodavanjem 7% janjeće krvi defibriniranom antibioticima (vankomicin, trimetoprim, amfotericin B i cefsulodin) kako bi se ograničio rast drugih vrsta bakterija koje mogu biti prisutne.

Ta ista baza nadopunjena ljudskom ili janjećom krvi, nalidiksičnom kiselinom i kolistinom korisna je za izolaciju Gardnerella vaginalis. Također je idealan za procjenu antimikrobne osjetljivosti na antibiotike istog mikroorganizma.

Osim toga, koristi se za pripremu krvnog agara za uzgoj anaeroba, dodavanje aminoglikozida i vankomicina.

Ova baza omogućuje nam da pravilno promatramo obrasce hemolize.

Brucella Agar

Ovaj medij koji se koristi kao osnova krvnog agara zajedno s dodatkom vitamina K idealan je za uzgoj anaerobnih bakterija. U tom se slučaju preporučuje uporaba janjeće krvi.

Campylobacter agar

Agar Campylobacter s 5% ovčje krvi i 5 antibiotika (cefalotin, amfotericin B, trimetoprim, polimiksin B i vankomicin) je medij koji se koristi za izolaciju Campylobacter jejuni u uzorcima stolice.

priprema

Svaka komercijalna kuća donosi na poleđinu pakiranja upute za pripremu litre medija za kulturu. Odgovarajući izračuni mogu se napraviti za pripremu željene količine, prema odabranom baznom agaru.

Izvagati i otopiti

Osnovni agar dolazi dehidriran (prah), pa se mora otopiti u destiliranoj vodi podešenoj na pH 7,3.

Količina naznačena odabranim baznim agarom se odvagne i otopi u odgovarajućoj količini vode u fioli, zatim se zagrije do umjerene topline i pomiješa s rotirajućim pokretima dok se sav prašak ne otopi..

sterilizirati

Nakon otapanja, sterilizirajte u autoklavu na 121 ° C 20 minuta.

Agregat krvi

Kada napustite autoklav, pustite da se fiola ohladi dok temperatura ne oscilira između 40 do 50 ° C; To je temperatura koju ljudska koža podržava i istovremeno agar još nije očvrsnuo.

U tu svrhu se rukom dodiruje fiola i ako je toplina podnošljiva, idealna je temperatura da se doda odgovarajuća količina defibrinirane krvi (50 ml po litri agara). Lagano se promiješa da se homogenizira.

Prolazak agregata krvi je presudan, jer ako se radi kada je medij vrlo vruć, crvene krvne stanice će se slomiti i medij neće služiti za promatranje hemolize..

Ako se doda previše hladno, stvaraju se kvržice i površina medija neće biti glatka kako bi flauta ispravno napravljena.

Ulijte u Petrijeve posude

Poslužite u sterilnim Petrijevim posudama odmah nakon homogenizacije krvi. U svaku Petrijevu posudu ulije se približno 20 ml. Ovaj se postupak provodi u laminarnom poklopcu protoka ili u blizini upaljača.

Kada poslužite krvni agar u Petrijevim zdjelicama, na površini ploče ne smiju ostati mjehurići zraka. Ako se to dogodi, plamen Bunsen plamenika se brzo prelazi preko ploče kako bi ih se uklonilo..

Ploče su ostavljene da se stvrdnu i pohranjuju u hladnjak (2-8 ° C) preokrenut do upotrebe. Prije upotrebe krvne ploče agara trebaju biti kaljene (neka se uzme sobna temperatura) da se sije.

Pripremljene ploče traju približno 1 tjedan.

reference

1. Bayona M. Mikrobiološki uvjeti za uzgoj Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013 28 (2): 94-99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktična klinička mikrobiologija. Sveučilište u Cadizu, drugo izdanje. Služba za publikacije UCA.
3. "Agar krv." Wikipedija, slobodna enciklopedija. 10 Dec 2018, 14:55 UTC. 27. prosinca 2018., 01: 49 en.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Uvodnik.
5. Laboratorijski centar za veterinarsku dijagnostiku CEDIVET. Gvatemala. Dostupno na: trensa.com.
6.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. (5. izd.). Argentina, Uredništvo Panamericana S.A..