Temelj, tehnike i primjene za bojenje spora



bojenje spora je metodologija koja se koristi za bojenje otpornih struktura koje formiraju neke bakterijske rodove kada su u nepovoljnim uvjetima; ove strukture odgovaraju načinu opstanka.

Postoje mnogi rodovi koji tvore spore; međutim, glavni su Bacillus i Clostridium. Ti se rodovi smatraju važnijim jer imaju patogene vrste za ljude.

Svaki bacil može dovesti do spore. U vrijeme bojenja preparata, spora se može naći unutar bacila (endospore) ili izvan njega (egzospore). S konvencionalnim tehnikama bojenja za bakterije - kao što je Gramova boja - spore ostaju bezbojne.

Trenutačno postoji nekoliko metodologija bojanja koje mogu preći debelu strukturu spora da bi je obojile. Te su metodologije vrlo različite; među njima možemo spomenuti Dornerovu tehniku, Möeller-ovu mrlju i Shaeffer-Fultonovu metodologiju, također poznatu kao Wirtz-Conklin..

Od svih navedenih tehnika, Shaeffer-Fultonova metodologija se najviše koristi u rutinskim laboratorijima. Ime mu duguje dva mikrobiologa koji su 1930. stvorili boju: Alicia Shaeffer i MacDonald Fulton. Međutim, ponekad se tehnika naziva Wirtz-Conklin u čast dva bakteriologa iz 1900-ih.

indeks

  • 1 Temelj
  • 2 Tehnike bojanja spora
    • 2.1 Dornerova tehnika
    • 2.2 Izmijenjena Dorner-ova tehnika
    • 2.3 Tehnika Shaeffer-Fultona ili Wirtz-Conklina
    • 2.4 Möeller tehnika
    • 2.5 Modificirana Möeller tehnika bez topline
  • 3 Upotreba
    • 3.1 Primjeri
  • 4 Reference

temelj

Spore ne mrlje konvencionalnim bojama jer imaju vrlo debeli zid. Složen sastav spora sprečava ulazak većine boja.

Ako se spore proučavaju izvana prema unutra, promatraju se sljedeći slojevi: prvo, egzosporij, koji je najtanji vanjski sloj koji tvore glikoproteini..

Zatim dolazi kutikula, koja pruža otpornost na visoke temperature, nakon čega slijedi korteks sastavljen od peptidoglikana. Zatim se nalazi zid baze koji štiti protoplast.

Spora je dehidrirana struktura koja sadrži 15% kalcija i dipikolinske kiseline. Stoga se većina tehnika bojanja spora temelji na primjeni topline tako da boja može prodrijeti u debelu strukturu.

Nakon što je spora obojena, ona ne može eliminirati boju. U Shaeffer-Fulton tehnici, malahitno zeleno ulazi u vegetativne stanice i, nakon primjene topline, prodire u endosporu i također u egzospore.

Kada se pere s vodom, boja se uklanja iz vegetativne stanice. Do toga dolazi zato što je zelena malahitna boja blago bazična, pa se slabo veže za vegetativnu stanicu.

S druge strane, ne može izaći iz spore i konačno kontrastira bacil sa safraninom. Ovaj temelj vrijedi za ostale tehnike u kojima se događa nešto slično.

Tehnike bojanja spora

Da bi spore bile mrlje, morate imati čistu kulturu sumnjivog soja koju želite proučavati.

Kultura je podvrgnuta ekstremnim temperaturama tijekom 24 sata da bi se mikroorganizam stimulirao na sporulaciju. Za to, kultura se može staviti u pećnicu na 44 ° C ili u hladnjak (8 ° C) tijekom 24 ili 48 sati.

Ako se na spomenutim temperaturama ostavi previše vremena, promatrat će se samo egzospore, jer će sve endospore napustiti bacil.

Na kraju vremena, nekoliko kapi sterilne fiziološke otopine treba staviti na čistu pločicu. Zatim se uzme mali dio usjeva i napravi se fini namaz. 

Nakon toga se ostavi da se osuši, fiksira se na toplinu i zamrlja se nekim od tehnika koje su objašnjene u nastavku:

Dornerova tehnika

1- Pripremite u epruveti koncentriranu suspenziju sporuliranog mikroorganizma u destiliranoj vodi i dodajte jednaku količinu filtriranog Kinyoun fenolnog fuksina.

2. Stavite epruvetu u kadu s kipućom vodom 5 do 10 minuta.

3- Na čistom poklopcu pomiješajte kap prethodne suspenzije s kapljicom 10% vodene otopine nigrozina, prokuhane i filtrirane.

4. Produžite i osušite brzo s blagom toplinom.

5- Ispitati sa 100X objektivom (uranjanje).

Spore crvene boje i bakterijske stanice izgledaju gotovo bezbojne na tamno sivoj podlozi.

Modificirana Dorner tehnika

1- Suspenzija sporuliranog mikroorganizma se širi na klizač i fiksira na toplinu.

2 - Uzorak je pokriven trakom filtar papira u koju je dodana fuksin fenske kiseline. Boja se zagrijava 5 do 7 minuta s plamenom Bunsen plamenika dok se ne oslobode isparenja. Tada je papir uklonjen.

3. Isperite preparat vodom i osušite upijajućim papirom.

4- Pokrijte razmaz tankim filmom od 10% nigrosina, koristeći drugi klizač za širenje nigrosina ili igle.

Boja koja se uzima od spora i bakterija je ista kao i ona opisana u stanju tehnike.

Shaeffer-Fulton ili Wirtz-Conklin tehniku

1 Na tankom klizaču napravite tanku posudu sa suspenzijom mikroorganizma koji je sporuliran i pričvrstite je na toplinu.

2. Pokrijte klizač vodenom otopinom 5% -tne malehitne zelene boje (filtarski papir se može staviti na list).

3. Zagrijte na plamenu Bunsen plamenika kako biste izbacili paru i uklonili plamen. Ponovite postupak 6 do 10 minuta. Ako tijekom postupka previše isparava malahitno zelena otopina, može se dodati još.

4. Uklonite filter papir (ako je postavljen) i operite ga vodom.

5. Pokrijte slajd s 0,5% vodenim safraninom tijekom 30 sekundi (neke varijante tehnike koriste 0,1% vodenog safranina i ostavite ga 3 minute).

Ovom tehnikom spore su zelene, a bacili crvene boje.

Nedostatak je da endospore mladih kultura ne mrlje dobro, jer izgledaju vrlo bistro ili bezbojno. Kako bi se to izbjeglo, preporučuje se uporaba kultura od 48 sati inkubacije.

Möeller tehnika

1. Pokrijte razmaz kloroformom 2 minute.

2 Odbacite kloroform.

3. Pokriti 5% kromnom kiselinom 5 minuta.

4. Isperite destiliranom vodom

5 - Ploča je pokrivena fuchsin-fenolnim šaranom i izložena plamenu Bunsenovog plamenika do emisije para; zatim se uklanja iz plamena na nekoliko trenutaka. Postupak se ponavlja dok ne dostigne 10 minuta.

6. Isperite vodom.

7. Koristite zakiseljeni etanol (klorovodični alkohol) za obezbojenje. Ostavlja se 20 ili 30 sekundi.

8 Isperite destiliranom vodom.

9- Kontrolirajte pokrivanje ploče metilenskim plavim tijekom 5 minuta.

10 Isperite destiliranom vodom.

11- Ostavi se da se osuši i uzorak se uzima pod mikroskopom.

Spore izgledaju crveno i plavo. Važno je ne udisati pare, jer su toksične i dugoročno mogu biti kancerogene.

Modificirana Möeller tehnika bez topline

2007. godine Hayama i njegovi suradnici stvorili su modifikaciju Möeller-ove tehnike. Uklonili su korak zagrijavanja boje i zamijenili ga dodatkom 2 kapi površinski aktivnog sredstva Tergitol 7 na svakih 10 ml otopine fuksina-fenolnog karbola. Dobiveni su isti rezultati.

aplikacije

Boja spora daje vrlo vrijednu i korisnu informaciju za identifikaciju patogena, budući da je prisutnost istog, njegov oblik, mjesto unutar bacila i sposobnost deformiranja vegetativne stanice ili ne, podaci koji mogu voditi vrstu uključeni u određeni spol.

U tom kontekstu, valja napomenuti da spore mogu biti okrugle ili ovalne, mogu se nalaziti u središtu ili također u paracentralnom, subterminalnom ili terminalnom položaju..

Primjeri

- Clostridium difficile oblikuje ovalnu sporu u terminalnom položaju koja deformira bacil.

- Spora Clostridium tertium Ona je ovalna, ne deformira bacil i nalazi se na terminalnoj razini.

- Endospore od Clostridium tetani ona je terminalna i deformira bacil, što daje izgled bačve.

- Spore Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. Novy i C. septicum oni su okrugli ili subterminalni ovalni i deformiraju bacil.

- Endospore od Clostridium sordelli Nalazi se u središnjem položaju, s malom deformacijom.

reference

  1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Prijedlog pojednostavljene tehnike bojenja bakterijskih spora bez primjene toplinski uspješne modifikacije Moellerove metode. Eur J Med Res. 16, 12 (8): 356-9.
  2. Doprinositelji Wikipedije. Moellerova mrlja. Wikipedija, slobodna enciklopedija. 3. studenog 2018., 03:28 UTC. Dostupno na: en.wikipedia.org
  3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratorijski priručnik za mikrobiološke tehnike. Zavod za temeljne znanosti Mikrobiološke akademije. Nacionalni politehnički institut.
  4. "Endospore". Wikipedija, slobodna enciklopedija. 25. veljače 2018., 10:20 UTC. 10 sij 2019, 02:42: hr.wikipedia.org
  5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J i suradnici. (2006). Radno osoblje Autonomne zajednice Extremadura. Konkretni program Volumen IV. Uvodnik MAD. Sevilla-Spain, str. 211-212.
  6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), specijalistički laboratorijski tehničar Galicijske zdravstvene službe (SERGAS). Sadržaj specifičnog sveska 2. Uvodnik MAD. Sevilla-Spain, str. 79-80.
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. (5. izd.). Argentina, Uredništvo Panamericana S.A..
  8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Uvodnik