Gram temeljna boja, materijali, tehnika i uporaba



Gramna mrlja je najjednostavnija i najkorisnija tehnika bojenja u dijagnostičkoj mikrobiologiji. Ovu tehniku ​​izradio je danski liječnik Hans Christian Gram 1884., koji je uspio klasificirati bakterije u Gram pozitivnim i Gram negativnim, prema sastavu stanične stijenke..

Tehnika je prošla određene izmjene Huckera 1921. kako bi se stabilizirali reagensi i poboljšala kvaliteta mrlje, tako da je Gram mrlja također poznata kao Gram-Hucker.

Ovom tehnikom moguće je promatrati i oblik koji mikroorganizmi imaju, tj. Jesu li to koki, bacili, kokobacili, pleomorfni, filamentozni. Kao i njezina raspodjela u prostoru: u klasteru, u lancu, izolirana, u parovima, u tetradama, itd..

Kada se posumnja na bakterijsku infekciju, većina primljenih uzoraka treba se rasporediti na slajd i obojiti Gramom za pregled pod mikroskopom..

Izvješće o Gramu vodit će liječnika o tome koja vrsta mikroorganizama može biti uzrok infekcije, prije dobivanja konačnog rezultata usjeva.

U nekim slučajevima život pacijenta je vrlo kompromitiran, pa liječnici hitno trebaju Gram-ovo izvješće kako bi proveli empirijsko liječenje, dok čekaju identifikaciju mikroorganizma..

Primjerice, ako Gram otkrije da u cerebrospinalnoj tekućini postoje Gram pozitivni koki, liječnik će početnu terapiju usmjeriti antibioticima koji eliminiraju ovu vrstu bakterija, prema protokolima koji su za njega uspostavljeni..

Kada stigne konačni rezultat s imenom izoliranog mikroorganizma i njegovim odgovarajućim antibiogramom, liječnik će procijeniti hoće li ili ne promijeniti terapiju. Ta će se odluka donijeti prema studiji osjetljivosti mikroorganizma na antibiotike koje prima i evoluciju pacijenta.

indeks

  • 1 Temelj
  • 2 Materijali
  • 3 Priprema bojila i reagensa
    • 3.1 Otopina kristalno ljubičaste boje
    • 3.2 Jodo-Lugol
    • 3.3 Izbjeljivanje
    • 3.4 Kontrast
  • 4 Skladištenje reagensa
  • 5 Priprema širenja uzorka za bojenje
    • 5.1-grama izravnih uzoraka
    • 5,2-Gram usjeva
  • 6 Tehnika
  • 7 Uslužni program
  • 8 Uobičajene pogreške
  • 9 Reference

temelj

To je tehnika koja predstavlja 4 temeljna koraka: bojenje, fiksiranje s trljanjem, gubitak boje i kontraktikaciju. Stoga ih ova tehnika, osim bojanja bakterija, također razlikuje.

Kristal ljubičica je prvo korišteno bojilo. Ima afinitet za peptidoglikan i ljubičastu boju svih prisutnih bakterija, zatim se postavlja lugol, koji djeluje kao mordant, tj. Inducira stvaranje netopivih kompleksa kristalno violet-jod - ribonuklearnih proteina unutar stanice.

Gram-pozitivne bakterije, koje imaju debeli zid peptidoglikana, formiraju više kompleksa (kristal violet-jod), stoga zadržavaju boju.

Također utječe na to da stijenka Gram-pozitivnih bakterija sadrži veću količinu nezasićenih kiselina, koje pokazuju visoki afinitet za oksidirajuća sredstva (Lugol)..

U međuvremenu, Gram-negativne bakterije imaju tanki sloj peptidoglikana, što čini bakterije manje kompleksnim od gram-pozitivnih bakterija.

Zatim dolazi korak gubitka boje, gdje se Gram pozitivne i Gram negativne bakterije ponašaju drugačije.

Gram negativne bakterije sadrže vanjsku membranu bogatu lipopolisaharidima koji su dio njegove stanične stijenke. Masti se uništavaju kontaktom s alkoholom acetonom, tako da se vanjska membrana destabilizira, kristal ljubičice se oslobađa.

Tako je onda kontra-obojena sa safraninom ili osnovnim fuksinom, uzimajući crvenu boju.

U slučaju Gram-pozitivnih bakterija, one se odupiru promjeni boje jer izbjeljivač zatvara pore, što sprječava izlaženje kompleksa kristalno ljubičastog / joda..

Stoga je obojenost s kristalom ljubičice stabilna i nema mjesta za safranin ili fuksin. Zbog toga ove bakterije mrlje intenzivno plave ili ljubičaste.

materijali

Gramski set za bojanje sastoji se od:

  • Ljubičasti kristali
  • Lugol
  • Aceton alkohol
  • Safranin ili osnovni fuksin

Priprema bojila i reagensa

Otopina kristalno ljubičaste boje

Rješenje A:

Ljubičasti kristal -2 gr

Etilni alkohol 95% -20 cc

Rješenje B:

Amonijev oksalat -0,8 gr

Destilirana voda-80 cm3

Za konačnu pripremu kristala ljubičice, otopinu 1:10 treba razrijediti destiliranom vodom i pomiješati s 4 dijela otopine B. Smjesa se čuva 24 sata prije upotrebe. Filtrira se u tikvici za boju jantara pomoću papirnog filtra.

Količina koja će se koristiti svakodnevno prenosi se u jantarnu bocu s kapaljkom.

Jod-Lugol

Izvagati i izmjeriti naznačenu količinu svakog spoja, kako slijedi:

Kristali joda - 1gr

Kalijev jodid - 2gr

Destilirana voda -300 cm3

Kalijev jodid se malo po malo otapa u vodi, a zatim se dodaje jod. Otopina je obrijana na bocu boje jantara.

Količina koja će se svakodnevno koristiti prebacuje se u manju jantarnu bocu s kapaljkom.

bjeljenje

95% etil-alkohol -50 ml

Aceton - 50 ml

Priprema se u jednakim dijelovima. Dobro pokrijte, teži isparavanju.

Stavite u bocu s kapaljkom.

Ovaj preparat osigurava promjenu boje u umjerenom vremenu od 5 do 10 sekundi i najviše se preporučuje.

Početnici preferiraju samo 95% etil alkohola, gdje je promjena boje sporija od 10 do 30 sekundi.

Dok najiskusniji mogu koristiti čisti aceton, gdje se promjena boje događa vrlo brzo od 1 do 5 sekundi.

kontrast

Osnovna otopina safranina

Safranina -2,5 gr

Etil alkohol 95% -100 cm3

Nakon vaganja naznačena količina safranina otapa se u 100 cm3 etilnog alkohola do 95%.

Radna otopina safranina priprema se iz osnovne otopine.

Da biste to učinili, izmjerite 10 cm3 temeljne otopine, dodajte 90 cm3 destilirane vode kako biste završili 100 ml.

Preporučuje se da iznos koji će se svakodnevno koristiti prebacite u jantarnu bocu s kapaljkom.

Mikroorganizmi koji slabo oslikavaju Gram s Gram-Hucker bojom, kao što su neki anaerobi, Legionella sp, Campylobacter sp i Brucella sp, mogu biti puno bolje obojeni ako se koristi modifikacija koju je napravio Kopeloff do Gram-Hucker boje, nazvan Gram-Kopeloff.

Ova tehnika mijenja boju safranina s bazičnom fuksinom. S ovom modifikacijom moguće je učinkovito bojiti gore spomenute mikroorganizme.

Skladištenje reagensa

Pripremljene boje treba čuvati na sobnoj temperaturi.

Priprema uzorka proširila se na boju

Uzorak mora sadržavati najmanje 105 mikroorganizama prije promatranja mikroorganizma u razmazu. Namazi se mogu načiniti od izravnog uzorka ili kultura u krutom ili tekućem mediju.

Namazi moraju biti ujednačeni, dobro raspoređeni i ne predebeli za bolju vizualizaciju prisutnih struktura.

-Gram izravnih uzoraka

Gram urina bez centrifuge

Mokraća se miješa i 10 μl se stavlja na klizač. Promatranje barem jednog polja bakterije / uranjanja pokazuje da postoji infekcija.

To znači da će kultura imati približno više od 100.000 CFU / ml (10%)5 CFU / mL) urina u 85% slučajeva.

Ova metoda nije korisna za brojanje kolonija ispod 100,000 CFU.

LCR Gram

CSF treba centrifugirati, supernatant ukloniti i pelet raspršiti na pokrov. Ova tekućina je sterilna pod normalnim uvjetima; promatranje bakterija ukazuje na infekciju.

Gram dišnih uzoraka

Ispljuvak Gram, bronhijalni ili bronhoalveolarni ispirak, iako postoji niz mikroorganizama, uvijek će voditi u dijagnozi, osim što je korisna vrsta promatranih stanica.

U slučaju sputuma, razmaz treba pripremiti s najviše gnojnim dijelovima uzorka.

Stolica Gram

Nije preporučljivo izvoditi Gram za ovu vrstu uzoraka, budući da nema dijagnostičku vrijednost.

-Urodi s gramima

Mogu se izvesti na dva načina, jedan od tekućih usjeva, a drugi iz čvrstih usjeva.

Tekući usjevi

Iz tekućih kultura je krajnje jednostavno; pod upaljačem uzima se nekoliko pečenja mutne juhe i stavljaju se na čisti i suhi klizač, dajući kružna kretanja od središta prema periferiji, da bi se materijal ravnomjerno rasporedio.

Pusti se da se spontano osuši u zraku. Kad se osuši, materijal se pričvršćuje na plahtu toplinom. Za to, uz pomoć stezaljke, list 3 prolazi 4 puta kroz plamen Bunsen plamenika, pazeći da ne izgori materijal.

Ploča se ostavi da se ohladi i stavi na most za bojenje.

Čvrsti usjevi

Za izvođenje proširenja za Gram mrlju iz čvrste kulture, postupite kako slijedi:

Prije odabira kolonija koje treba uzeti, klizač treba pripremiti, stavljajući otprilike dvije kapi sterilne fiziološke otopine.

Ako originalna pločica za kulturu sadrži nekoliko različitih tipova kolonija, izolirana kolonija svakog od njih bit će odabrana za obavljanje Gram. Svaka kolonija će se uzeti s platinastom petljom kako bi se otopila u otopini soli koja je prethodno stavljena na klizač.

Kružnim pokretima daje se od središta prema periferiji, kako bi se kolonija homogeno rasporedila na slajdu..

Pusti se da se spontano osuši u zraku. Nakon sušenja, ploča se fiksira toplinom, kao što je gore objašnjeno (plameni klizač s upaljačem), pazeći da ne zapali materijal.

Ovaj se postupak mora obaviti sa svakim različitim tipom kolonije. Na komad papira treba navesti redoslijed promatranog, na primjer:

Kolonija 1: Žuta beta-hemolitička kolonija: Gram-pozitivni koki su opaženi u klasterima

Kolonija 2: Kremna kolonija, bez hemolize: Promatrani su gram negativni kokobacili.

Svaki list mora biti označen da bi se znalo što promatramo.

tehnika

Tehnika bojenja po Gramu je iznimno jednostavna za izvođenje i relativno jeftina i ne može se propustiti u mikrobiološkom laboratoriju.

Isto se radi na sljedeći način:

  1. Učvrstite razmaz toplinom i stavite ga na obojeni most.
  2. List je potpuno pokriven ljubičastim staklom 1 minutu.
  3. Isperite vodom. Nemojte sušiti
  4. Pokrijte ploču otopinom Lugola, ostavite 1 minutu. Isperite vodom. Nemojte sušiti.
  5. Miješati 5-10 sekundi uz lagano miješanje u acetonskom alkoholu. Ili postavite plahtu u uspravan položaj i ispustite kapljice sredstva za obezbojenje na površinu dok se preostalo ljubičasto staklo ne povuče. Nemojte prekoračiti.
  6. Isperite vodom. Nemojte sušiti.
  7. Zamijenite plahtu na obojenom mostu i pokrijte 30 sekundi safraninom (Gram-Hucker) ili 1 min s osnovnom fuksinom (Gram-Kopeloff).
  8. Isperite vodom
  9. Pustite da se spontano osuši u okomitom zraku.

Kad se osuši, stavite 1 kap ulja za uranjanje kako biste ga promatrali pod optičkim mikroskopom pod objektivom 100X.

korisnost

Ova tehnika omogućuje razlikovanje morphotyincijalnih razlika kod većine bakterija.

Kvasac se također razlikuje po ovoj boji. Uzimaju kristalno ljubičastu, tj. Onečišćavaju Gram pozitivne.

S druge strane, može se razlikovati gram-pozitivne bacile koji tvore spore, u kojima se unutar bakterije, gdje se formira endospora, vidi jasan prostor, iako spore ne mrlje dobro. Za korištenje spora koriste se druge tehnike kao što je Shaeffer-Fulton.

Valja napomenuti da ova mrlja ne služi za bojenje svih vrsta bakterija, to jest, postoje slučajevi u kojima bojenje ne djeluje.

U ovom slučaju mogu se spomenuti bakterije koje nemaju staničnu stijenku. Na primjer: rod Mycoplasma, sferoplasti, Ureaplasma, L-oblici i protoplasti.

Također jako prlja bakterije zidovima bogatim mikoličkim kiselinama, kao što su mikobakterije i unutarstanične bakterije kao što su Chlamydias i Rickettsias.

Također je neučinkovito obojiti većinu spirohetalnih bakterija.

Postoje bakterije istog roda koje se mogu promatrati u istom uzorku kao Gram pozitivne i kao Gram negativne. Kada se to dogodi naziva se varijabilna boja po Gramu, koja može biti posljedica promjene u hranjivim tvarima, temperaturi, pH ili koncentraciji elektrolita..

Uobičajene pogreške

Izbjeljivati ​​pretjerano

Pretjerivanje u koraku diskoloracije može uzrokovati promatranje lažnih gram-negativnih mikroorganizama.

Nemojte čekati dovoljno vremena za sušenje da biste dodali ulje za uranjanje:

Ta pogreška uzrokuje stvaranje masnih micela koje otežavaju promatranje prisutnih struktura. To se događa kada ulje spaja molekule vode prisutne u razmazu.

Poništite redoslijed reagensa:

Pogreška poput ove uzrokovat će pojavu gram-negativnih bakterija ljubičaste, tj. Lažne Gram-pozitivne.

Koristiti stare usjeve (čvrste ili tekuće):

Može uzrokovati da Gram pozitivne bakterije oboje negativno po Gramu (lažni Gram negativan). To se događa jer u starim kulturama postoji vjerojatnost da postoje mrtve ili pogoršane bakterije i pod tim uvjetima bakterije ne zadržavaju kristal ljubičice.

Koristite vrlo staro rješenje Lugol:

Tijekom vremena lugol gubi svoja svojstva i boja blijedi. Ako se koristi već degenerirani reagens, on neće dobro fiksirati kristalno ljubičastu bušotinu, stoga postoji mogućnost dobivanja vizualizacije mikroorganizama lažno Gram negativnih.

Plavkasta pozadina

Pozadina s ispravnom bojom bit će crvena. Plava pozadina pokazuje da je obezbojenje bilo nedovoljno.

reference

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. sherris. mikrobiologija Medical, 6. izdanje McGraw-Hill, New York, SAD
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka dijagnoza. (5. izd.). Argentina, Uredništvo Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Uvodnik
  4. Casas-Rincón G. 1994. Opća mikologija. 2. izdanje Universidad Central de Venezuela, Knjižnična izdanja. Venecuela, Caracas.
  5. "Gram boja" Wikipedija, slobodna enciklopedija. 4. listopada 2018., 23:40 UTC. 9. prosinca 2018., 17:11. Preuzeto s es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Priručnik za medicinsku mikrobiologiju. 2. izdanje, Venezuela: Uprava za medije i publikacije Sveučilišta Carabobo.
  7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franko-Cendejas F. Osnovno bojenje u mikrobiološkom laboratoriju. Istraživanje o invalidnosti. 2014; 3 (1): 10-18.