Wrightova temeljna boja, materijali, tehnika i uporaba



Wrigthova mrlja je tehnika bojanja koju je 1902. godine stvorio američki patolog James Homer Wright iz mrlje Romanovskog. Kako je mrlja Romanowskvja bila nestabilna, Wrigth je uključio metanol kao otapalo i fiksativ.

Ova obojenost je polikromatska, što znači da stvara nekoliko boja ovisno o strukturi koju boja apsorbira. Ova tehnika bojenja je široko korištena za izvođenje diferencijalnih brojeva bijelih krvnih stanica i proučavanje morfologije crvenih krvnih stanica, trombocita i leukocita u perifernoj krvi i koštanoj srži..

Njegova primjena je vrlo važna, budući da se abnormalnosti mogu vidjeti u različitim staničnim linijama krvi, olakšavajući dijagnozu bolesti poput leukemije ili bakterijskih ili parazitskih infekcija..

Možda su to najčešće primjene u kojima se ova tehnika koristi, ali nisu jedine. Također je koristan u uzorcima osim krvi i koštane srži, kao što su uzorci nazalnog iscjedka, fekalne sluzi, sputuma, kože, između ostalih..

indeks

  • 1 Utemeljenje Wrightove mrlje
  • 2 Materijali
    • 2.1 Priprema
    • 2.2. Puferirana pufer otopina
    • 2.3 Dodatni materijali potrebni za bojanje
  • 3 Komponente Wrightove mrlje
    • 3.1 Metanol
    • 3.2 amortizer
    • 3,3 Eosin (Y)
    • 3.4 Metilensko plavo
  • 4 Tehnika
  • 5 Uslužni program
    • 5.1 Hematologija
    • 5.2 Izlučivanje nosa
    • 5.3 Parazitologija
    • 5.4 Respiratorne infekcije
    • 5.5 Bakteriologija
    • 5.6 Mikologija
  • 6 Kako se promatraju strukture uzorka krvi s Wrightovom mrljom??
  • 7 Preporuke za dobro bojenje
  • 8 Uobičajene pogreške u Wrigth boji
    • 8.1 Jako blijedo bojenje
    • 8.2 Precipitati boje
    • 8.3 Razmazati iznimno crvenkastom ili plavom bojom
  • 9 Način pohrane
  • 10 Reference

Wrightov temelj za mrlju

Wrightova mrlja nastala je iz mrlje Romanowskog, koji se sastoji od otopine metilnog alkohola iz kiselinske boje (eozin Y) i osnovne (metilensko plava) i njegovih oksidacijskih produkata..

Mješavina boja korištenih u Wrightovoj boji uzrokuje učinak poznat kao Romanowsky, to jest, daje lijepu ljubičastu boju jezgrama leukocita i neutrofilnim granulama, dok su crvene krvne stanice obojene ružičasto..

Komponente odgovorne za davanje raspona boja tipičnih za Wrightovu boju su plava B i eozin Y. Uočeni učinak ovisit će o vezanju bojila za kemijske strukture i interakcijama plave B i eozina Y..

Kisele strukture kao što su nukleinske kiseline, nuklearni proteini i reaktivna nezrela citoplazma nekih tipova stanica, fiksni plavi B (osnovna boja).

Dok osnovne strukture kao što su hemoglobin, granule segmentiranih eozinofila, među ostalim staničnim strukturama, fiksiraju eozin Y (kiselinska boja).

Na rezultat bojenja mogu utjecati različiti faktori, kao što je pH Wright boje, pufer i otopina za ispiranje; kao i vrijeme bojenja i fiksiranja.

Stoga je svaki korak u pripremi reagensa presudan i mora biti učinjen vodeći računa o svakom detalju.

materijali

Wrightovo bojanje. Za 100 mL je potrebno:

Odvijte 0,3 grama Wright boje, izmjerite 97 ml metanola i 3 ml glicerola.

priprema

U žbuci stavite tešku količinu Wrightove boje i polako dodajte glicerol dok se prah potpuno ne otopi..

Zatim se doda metanol, pomiješa i prelije u jantarnu bocu.

Prije uporabe otopinu treba protresti s blagim pokretima i filtrirati.

Puferirani pufer

U litru destilirane vode, 3,76 g dinatrijevog hidrofosfata (Na2HPO4   2H20) plus 2.1 gr kalijevog dihidrogen fosfata (KH)2PO4).

Dobro promiješajte sve dok se svi ugrađeni reagensi ne otope. Podesite pH na 7,2. Ulijte u staklenu posudu i čuvajte na sobnoj temperaturi.

Dodatni materijali potrebni za bojanje

Osim toga, drugi materijali su potrebni za izvođenje tehnike bojanja, to su: listovi koji nose predmete ili pokrivaju objekte, mostove obojenosti, pisetas s vodom ili puferom za pranje, štopericu za uzimanje vremena bojanja i neki materijal za sušenje (upijajući papir, gaza ili pamuk).

Komponente za boju Wright

metanol

Alkohol (metanol) služi kao fiksativ za razmaz krvi.

U osnovi, to je reducirajući reagens, dehidrator i fiksator za koagulaciju. Stoga je njegova funkcija koagulirati proteine ​​i učiniti ih netopljivima, ali bez da ih denaturiraju.

Metanol je najkorišteniji reagens za popravljanje razmaza u svim laboratorijima, jer daje bolje rezultate od onih dobivenih etanolom. Idealna koncentracija je 99%.

Amortizer

Pufer (puferirana otopina) ima funkciju podešavanja ili održavanja pH boje, budući da je pH podešen na 7.2 bitan za stanične strukture koje apsorbiraju boje.

S druge strane, prolazak metanolske fiksacije dehidrira stanice i pufer ih pomaže rehidrirati.

Eosin (Y)

Eozin ima afinitet prema osnovnim komponentama jer je to kisela boja. Dvije vrste eozina su vrlo slične jedna drugoj, tako da se može upotrijebiti bilo koji od dva, dobivši isti rezultat.

Jedan se naziva eozin Y, žuti eozin ili tetrabromofluorescein i drugi eozin B, plavkasti eritrozin B ili dibromodinitrofluorescein. Međutim, eozin Y je najčešće korišten.

Najvažnije svojstvo ove boje je njegov negativni polaritet, zbog čega ga privlače stanične strukture s pozitivnim nabojem.

Metilensko plavo

To je osnovno bojanje. Njezino glavno svojstvo je metahromazija, to jest, neće sve strukture biti obojene istom bojom, to ovisi o kemijskom sastavu struktura koje boje.

Neki će postati svijetli ili tamno plavi, a drugi tamno ljubičasti ili blijedožuti.

tehnika

1-Provedite rasprostiranje uzorka tako da ostane tanak film na slajdu ili pokrovu.

2-Ostavite da se zrak suši oko 2 sata.

3 - Stavite suhi razmaz na mrlju za mrlje ili pladnju za bojenje s uzorkom koji se širi prema gore.

4-Pokrijte plahtu kapljicom Wright boje kap po kap dok ne prekrije cijelu površinu. Ostavite da stoji 5 - 8 minuta.

5-Boja mora u potpunosti prekrivati ​​klizač, bez prosipanja preko rubova. Ako se tijekom vremena bojanja počne isparavati, treba postaviti dodatne kapi.

6-Nakon toga dodajte jednaku količinu amortizera, puhnite malo dok se ne pojavi karakterističan metalik sjaj. Uzmite 10 do 15 minuta.

7. Isperite vodom iz slavine, stavite mekani mlaz sve dok list ne postane ružičast.

8-S gazom impregniranom alkoholom uklonite boju pričvršćenu na stražnju stranu klizača.

9 - Pustite da se razmaz dobro suši prije stavljanja ulja za uranjanje u mikroskop.

korisnost

hematološki

Idealan je za razmazivanje razmaza periferne krvi, za ispitivanje debelih krvnih razmaza i za proučavanje stanica iz uzoraka koštane srži..

Zbog kemijskih svojstava ove kombinacije boja lako se prepoznaju stanične strukture, koje su u stanju razlikovati različite tipove prisutnih stanica..

Nazalna sekrecija

Ova tehnika je vrlo korisna za identifikaciju stanica nazalne sekrecije (epitelne stanice, segmentirani eozinofili, polimorfonuklearni) u dijagnostici alergijskog rinitisa.

parazitologija

U tom smislu, bilo je korisno za proučavanje Leishmania sp unutar histiocita potkožnog staničnog tkiva u kožnim čirevima. Isto tako, koristi se za identifikaciju leukocita u uzorcima stolice (fekalni leukogram).

U ovom slučaju, od interesa je za liječnika da zna je li leukocitoza prisutna u izmetu polimorfonuklearna ili mononuklearna. Ovaj nalaz u fekalnom leukogramu vodit će ako je to bakterijska ili virusna infekcija.

S druge strane, paraziti koji cirkuliraju u krvi mogu se naći unutar eritrocita ili slobodni u plazmi. Željeni paraziti su Plasmodium spp., Trypanosoma cruzii i filarijima, au veterinarskoj medicini korisno je u potrazi Theileria equi i Babesia caballi, uzročnika beba, osobito kod kopitara.

Wrightova i Giemsa boja mogu razlikovati hemoparazite od normalnih staničnih komponenti. U tu svrhu možete koristiti dvije vrste širenja:

Fino rastezanje

Krv se širi poput tankog filma na slajdu. Obojen Wrightovom mrljom, otkrivajući obilježja jezgre i citoplazme.

Gusta kap

Ova se metodologija koristi za ispitivanje prisutnosti parazita u većoj količini krvi.

Za to je na slajd stavljena velika kap krvi. Kad stignete tamo, trebali biste defibrinirati, stvarajući veće i veće krugove od sredine prema van, koristeći rub drugog slajda.

Konačno, kako bi se promatrali paraziti u debelom razmazu, eritrociti se moraju lizirati vodom..

Infekcije dišnog sustava

Na dišnom nivou ova tehnika je također korisna, jer su stanice prisutne u uzorcima sputuma, bronhijalnom ili bronhoalveolarnom ispiranju, važne za uspostavljanje dijagnoze..

Isto tako, ovdje se mogu razlikovati polimorfonuklearne stanice i mononuklearne stanice.

bakteriologija

Primjena ove tehnike u bakteriologiji je ograničena, jer nije dobra za bojenje bakterija, zbog čega se za bojanje koriste druge specijalizirane tehnike bojanja..

Međutim, koristi se za traženje epitelnih stanica s inkluzijskim tijelima Chlamydia trachomatis u razmazu uretralne ili endocervikalne sluznice, iako se mora priznati da to nije najbolji način za to.

Također je moguće promatrati spiralne bakterije među crvenim krvnim stanicama kao Borrelia burgdorferi kod zaraženih pacijenata, kao i morula ili inkluzijskih tijela Ehrlichia sp u citoplazmi limfocita, monocita ili neutrofila u razmazu krvi.

mikologija

Histoplasma capsulatum je patogena gljivica koja se često dijagnosticira mikroskopskim promatranjem različitih uzoraka tkiva, obojenih Wrightovom bojom.

Kako su strukture uzorka krvi promatrane s Wrightovom mrljom?

Preporuke za dobro bojenje

Produženje krvi treba spontano osušiti na zraku. Razmazi moraju biti što je moguće tanji kako bi se postigla bolja fiksacija boje i izbjegla prekomjerna obrada.

Za visokokvalitetno bojanje preporučuje se bojanje tijekom dva sata nakon pripreme razmaza. S druge strane, idealan uzorak je kapilarna krv, bez antikoagulanta.

Međutim, ako se upotrebljava venska krv, treba je koristiti kao EDTA antikoagulant, a ne kao heparin, budući da ona može deformirati stanične strukture..

Da bi se spriječilo propadanje, pripremljeno bojilo treba čuvati na suhim mjestima.

Tijekom procesa pranja preporučuje se korištenje vode prilagođene neutralnom pH.

Konačno, preporučljivo je testirati metode bojadisanja koje se često koriste u laboratoriju.

To se postiže bojanjem uzoraka ili proširenih uzoraka, kao kontrola kvalitete. Ovaj korak je važan, jer to osigurava da je bojanje pravilno pripremljeno i da su vremena bojanja dobro standardizirana.

Ako je list obrasca loše obojen, onda postoje problemi koji se moraju riješiti.

Uobičajene pogreške u Wrigth boji

Vrlo blijedo bojenje

Vrlo blijede mrlje, obično zbog vrlo kratkog vremena bojenja ili vrlo pretjeranog pranja. Ispravlja se produljenjem vremena kontakta s bojom ili smanjenjem vremena pranja.

Boja se taloži

Prisutnost precipitata boje u razmazu može imati nekoliko uzroka, međutim, najčešći uzroci su: upotreba nefiltrirane boje, bojenje na neravnim mostovima za bojenje, korištenje prljavih listova s ​​prašinom ili masnoćom, ne ispiranje Završi bojenje.

Razmažite izrazito crvenkastom ili plavom bojom

Pufer je odgovoran za pH boje. Boje s pH ispod naznačene (kiseline) rezultirat će vrlo crvenim razmazima.

Ako je pH boje iznad (alkalna), dobije se izrazito plavkasti razmaz.

Način pohrane

Reagens treba čuvati na sobnoj temperaturi.

reference

  1. Gutiérrez V. Usporedna studija između Wrightove metode bojenja i Elisa testa za dijagnozu Ehrlichiosis canina u gradu San Pedro Sula, Honduras. 2008. Diplomski rad za prijavu na titulu Veterinarskog liječnika. Sveučilište San Carlos de Guatemala.
  2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franko-Cendejas F. Osnovno bojenje u mikrobiološkom laboratoriju. Istraživanje o invalidnosti. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wrightova mrlja." Wikipedija, slobodna enciklopedija. 18. svibnja 2018., 12:05 UTC. 8. prosinca 2018., 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara. Učestalost Babesia spp. u konjima montería, Córdoba (Kolumbija). Rev. udcaactual divulgium.  2013 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiološka dijagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Panamericana S.A Uvodnik.
  6. Retamales E, Mazo V. Institut za javno zdravstvo Vlada Čilea. Preporuke za bojenje razmaza krvi za čitanje krvne slike.